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细菌原生质体融合在育种中的应用 摘要：原生质体融合是细胞融合技术，也是遗传育种有效的方法之一。文中综述了原生质体融合的基本流程及影响细胞原生质体融合的因素和原生质体融合技术在育种中应用的研究进展。 关键字：原生质体， 细胞融合，遗传育种。 细菌原生质体融合（protoplast fusion）是通过人工方法将不同种的细胞通过无性繁殖方式融合成为一个核或者多核的杂合细胞的过程，进而获的双亲优良遗传形状，打破了微生物的种界界限，实现远缘菌株的基因重组，可使遗传物质传递更为完整。获得更多基因重组的机会。还可以与其他育种方法相结合，如把常规诱变和原生质诱变所获得的优良性状，组合到一个菌株中。原生质体融合技术起源于20世纪60年代。1960年法国的karski研究小组在两种不同类型的动物细胞混合培养中发现了直发融合现象。1974年匈牙利的Ferenczy L等[1]采用离心力诱导的方法，报道了白地霉营养缺陷型突变株的原生质体融合，从而使原生质体融合技术成为微生物育种的一项新技术，并从微生物种内融合扩展到界间的融合。原生质体融合技术已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果，而且应用领域在不断扩大[2] 1．细菌原生质体融合技术 微生物原生质体融合技术的整个过程包括：原生质体的制备，原生质再生，融合，融合子的检出，遗传特性分析和测定。 1.1细菌原生质体的制备和再生 在原生质体的制备过程中，需要；考虑的是如何去除去除细胞壁，目前用于去壁的方法主要有机械法、非机械法（非酶法和酶法），而酶法是目前应用比较广泛的方法。其中，菌种的类型影响酶种类的选择，在放线菌和细菌中，主要采用溶菌酶，酵母菌和霉菌一般用蜗牛酶、消解酶或纤维素酶等。影响原生质体制备和再生的因素中，菌龄是一个因素，为了使细胞易于原生质体化，一般选择对数生长期或生长中期的菌体，也有的采用生长后期的菌，酶浓度以及作用时间也会影响原生质体的制备和再生率，一般来说酶的浓度越高，作用时间越长、原生质体的制备率就越高，但酶解时间过长又会影响再生率。对于不同的菌体，优化其最适酶溶度和作用时间非常必要。 1.2原生质体的融合 在自然条件下，原生质体发生融合的频率非常低，因此在实际育种过程中要采用一定的方法进行人为诱导融合。在微生物融合的过程中，常用诱导方法可分为：物理法（包括电融合和激光诱导融合法）和化学法（PEG结合高Ca2+、pH诱导法）。 在用PEG法诱导原生质体融合时，很多因素影响融合频率。PEG的浓度、PEG的聚合度、离子种类和融合剂pH、温度等。一般来说，PEG浓度为30-50%，相对分子质量在1000-6000的PEG都是有效的。在融合过程中，适量的Ca2+,Mg2+有助于融合，而K+，Na+则会使融合率降低。PEG加入，融合时间较长有利于提高融合率，但PEG有毒害作用，因此要筛选合适的PEG处理时间，通常PEG处理时间控制在1-10min。 电融合法：1978 年 ZIMMERMANN U 等[3]报道了电融合技术，在短时间强电场作用下，细胞膜发生可逆性电击穿，瞬时失去高电阻和低通透特性，数分钟后恢复原状，当可逆电击穿发生在 2 个相邻细胞接触区时，即可诱导它们的膜相互融合。余荔华等[4]对克氏固氮菌（Klebsiellaoxytoca）与枯草芽孢杆菌电融合技术进行了研究，获得了较高的融合频率。 激光诱导融合法：激光诱导融合是利用激光的光镊建立细胞间接触，利用激光微束对相邻细胞的接触区进行破坏，从而诱导2个相邻细胞融合。使用这项技术时，为促使细胞接触使用光俘虏法，也可结合使用低浓度的融合剂 PEG（5%）使细胞聚集[5]。朱振华等在融合枯草芽孢杆菌与黑曲霉原生质体时，用 He-Ne 激光诱导与 PEG 溶液一起促融效果较好，并且 He-Ne 激光照射4min 时融合频率最高为 9.16*10-5。 1.3融合子的筛选 根据筛选融合子的原理不同，可以分为：利用营养缺陷型标记筛选融合子，利用抗药性标记筛选融合子；利用灭活标记筛选融合子；利用荧光染色标记筛选融合子；利用某些特殊的生理特征作为标记筛选融合子；利用其它标记筛选融合子。 2、影响细菌原生质体融合的因素 用 PEG 作融合剂时，影响原生质体融合的因素很多，如 PEG 分子量与浓度、pH 值、离子种类与浓度、PEG 作用时间、温度、原生质体纯净与否、培养条件、酶解制备原生质体条件等对融合率都有一定的影响[6]。 细胞电融合由于融合频率高、融合迅速和毒害小的优点被广泛应用。融合率与电场强度、脉冲强度和脉冲个数有关。魏明宝等[7]将荧光蛋白标记的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa）和少动鞘氨醇单胞菌（Sphingom-onas paucimobotis）原生质体进行电融合，随着电场强度、脉冲强度和脉冲个数