流式细胞仪实验方法及常见问题分析文稿.ppt

流式细胞仪实验方法及常见问题分析 中心实验室 李 琳 2012.09.19 流式细胞仪（Flow Cytometer）是集多种技术为一体的新型高科技仪器。 流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式细胞仪为检测手段，对处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒同时进行多参数定量分析和分选的高新技术。 研究对象：各种细胞、微生物、人工合成微球等。 BD FACSAria 中心实验室的流式能做什么？ 流式实验需要做哪些准备和工作？ 流式细胞仪检测范围 细胞结构 细胞功能 细胞大小 细胞粒度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA 含量 蛋白质含量 染色体分析 特异性抗原（细胞表面/胞浆/核） 细胞活性 细胞因子 酶活性 激素结合位点 细胞受体 凋亡 在上述信号基础上的细胞分选（未开展分选） 单细胞标本的制备 标记荧光抗体 检 测（老师） 数据分析 FCM 实 验 流 程 一、单细胞标本的制备 （关键步骤） 6种标本来源 ① 外周血单细胞悬液制备 新鲜的外周血是天然的单细胞悬液，需要用红细胞裂解液裂解RBC。 ② 培养细胞的单细胞悬液制备 ③ 脱落细胞的单细胞悬液制备 脱落细胞应去除取材伴随的杂质后再制备细胞悬液。 对临床诊断和治疗很有意义，比如脱落的肺泡细胞。  ④ 新鲜实体组织单细胞悬液制备 常用方法：酶消化法、机械法、化学处理法、表面活性剂处理法等。 不论哪种方法都不可避免会对细胞表面膜结构、细胞活性和功能造成不同程度的损伤。 ⑤ 活检标本单细胞悬液制备 方法：与新鲜实体组织基本相同，要求镜检 取材标本至少取3块以上。 ⑥ 石蜡包埋组织单细胞悬液制备 常用方法：二甲苯脱蜡法、组织清洁剂脱蜡法、甲氧-双氧水处理法。 扩大了流式的应用范围，有利于进行临床回顾性研究。 评判单细胞悬液制备的标准 细胞团块、碎片尽可能少，不能出现肉眼可见的团块，上机前细胞必须过300目滤膜。 细胞呈单个分散状态。 细胞浓度：5×105~1×106 分散过程中细胞的活性不受到明显的损害，以保证下一步的荧光染色处理。 样品制备过程中常见的问题及解决对策 常见问题 原 因 解决对策 细胞密度低 制备过程中细胞损失 增加离心时间、吸弃上清 非特异荧光强 抗体不纯、死亡细胞多 选择纯度高的抗体、用同型对照抗体或双标记排除非特异荧光 碎片多 细胞死亡、机械损伤 在细胞生长状态良好时测试、避免反复吹打 细胞聚集 消化不完全、酒精固定造成的细胞粘连 彻底消化、在用酒精固定细胞时加入终浓度为1.5-3％的小牛血清 荧光弱 灵敏度不够、抗体加入量不饱和、反应时间短 改用生物素-亲和素、增加抗体用量、延长反应时间 测不出亚二倍体峰 凋亡测试方法选择不当 改用原位末端标记或Annexin-V和PI双标记法 二、标记荧光抗体 直接免疫荧光染色：细胞与抗体反应，多用于细胞 表面标志的染色分析。 间接免疫荧光染色：先用一抗与待测抗原反应，再用二抗（荧光素标记）进行标记。 选择合适的荧光染料 必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发。（激发光源488nm\633nm\407nm） 激发的光谱必须在仪器上滤光片能够接受的合适范围。 荧光素光谱的重叠应当尽量减少。 一定要选择商业化的流式用单克隆抗体，此类抗体在制备过程中有严格的质控，非特异荧光弱。最好用直标抗体，如果是用间标抗体，二抗的选择更应严格。 影响荧光染色效果的因素 温度：高温时荧光淬灭的可能性增大。 pH值：其改变会导致荧光光谱改变，影响荧光强度。 固定剂：与细胞的某些物质结合后，干扰荧光染料与细胞成分的结合，造成荧光强度改变。 其他：孵育时间、溶剂的性质、细胞浓度等。 三、上机检测（老师） 设门 画图 电压调节 荧光补偿 样本收集 仪器维护和质控 举例 1 采样软件 举例 2 单参数直方图 举例 3 点图 举例4 凋亡测定 举例5 CBA