[高级技能训练：分子生物学实验技术09.10.09.docVIP

分子生物学实验指导 江南大学 营养 2009年09月  目 录 实验一 总RNA的提取和纯化 1 实验二 RNA的甲醛变性电泳 3 实验三 RT－PCR 5 实验四 PCR基因扩增 7 实验五 琼脂糖凝胶电泳检测DNA 9 实验一 总RNA的提取和纯化 【实验目的】 通过本实验学习从鼠肝中提取RNA的方法。 【实验原理】 每一个真核细胞约含10-5μg RNA。理论上每克细胞可分离出5-10mgRNA，其中80-85%是rRNA（主要是28S、18S和5SrRNA），10-15%tRNA和核内小分子RNA，以及1-5%的mRNA。mRNA是一类分子量不均一的RNA，是分子生物学的主要研究对象之一。提取高纯度完整的RNA，是研究基因表达、体外转录、构建cDNA文库、RT-PCR、Northern杂交的重要基础环节。大多数真核细胞mRNA的3′末端有polyA组成的尾，利用此特性，可以方便地用寡聚（dT）亲和层析柱分离mRNA。 本实验按照TRIzol法提取总RNA。可用于人、动植物、微生物总RNA的提取分离。TRIzol中含有RNase抑制剂异硫氰酸胍、β-巯基乙醇和去污剂N-十二烷基肌氨酸钠，可有效的抑制RNA降解，保持RNA的完整性；同时，增强了对核蛋白复合物的解离，使RNA与蛋白分离，在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA选择性地进入无蛋白和DNA的水相中，容易被异丙醇沉淀。氯仿不但有一定的蛋白质变性作用，而且能迅速使各相分离，使DNA与其它成分分开。异丙醇使RNA沉淀浓缩。 由于mRNA分子的结构特点,容易受RNA酶的攻击反应而被降解，加之RNA酶极为稳定且广泛存在，人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此，在提取过程中要严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性，这是本实验成败的关键。在全部实验过程中均需戴手套（使用一次性手套）、口罩操作。所用的玻璃器皿、塑料容器等均需进行处理后方可使用（详见注意事项），实验所用试剂可用含有0.1% DEPC 121℃高压灭菌处理后的水配置。 【仪器、材料与试剂】 仪器 冷冻离心机、台式离心机 制冰机、恒温水浴锅、马福炉、高压灭菌锅 材料 eppendorf管、吸头、枪头盒、eppendorf管盒、冰盒 移液枪：5-40μl 、40-200μl 、200-1000μl 手术剪刀、镊子、托盘、匀浆器 小鼠肝组织 试剂 Trizol 氯仿、异丙醇、DEPC水 无水乙醇、70％乙醇：4℃预冷 3 mol/L NaAc 【实验步骤】 动物在实验前禁食8-10小时。取100 mg新鲜肝组织加1 ml TRizol（预冷）试剂，于冰浴中匀浆，匀浆速度要快，使肝组织迅速接触到变性剂，避免组织内源RNA酶的污染。然后将匀浆液转移至1.5 ml 离心管中，冰浴10 min； 加入200μl（或1/ 5体积）的氯仿，剧烈振荡混合30 s，室温2-5min，静置分层。4℃ 12000 rpm 离心 15 min。离心管中液体分为3层：上层为水相，RNA在此相中，蛋白质在下层黄色的有机相中，DNA保留在上下两层的界面处的中间层中； 小心吸取上层水相约0.4ml 于新的塑料离心管中（切勿吸取中间层和下层液体）。加入1倍体积的4℃预冷的异丙醇，室温放置10 min（或-20℃静置30 min以上）； 4℃ 12000 rpm 离心15min，沉淀RNA，弃上清； 用1 ml 预冷的75%乙醇洗涤沉淀，12000 rpm 4℃离心5min，弃尽上清. 重复步骤5，然后室温中自然干燥10 min，至RNA呈半透明状即可； 根据RNA提取量加约100μl DEPC处理的水溶解沉淀，65℃水浴10min，立即置于冰上，得到所提取的RNA溶液。 如须保存，可加0.1体积的3M醋酸钠（pH 5.2）和2.2倍体积的冰无水乙醇，充分混匀，于-70℃低温保存。或用稳定的甲酰胺溶解（4mg/ml）, -20℃保存，用时，4倍乙醇沉淀，回收RNA。 【RNA纯度、浓度测定及分子完整性的鉴定】 RNA是否能用于后续实验，取决于它的纯度和分子的完整性，常用的鉴定方法是测定样品260 nm与280 nm的光吸收值以及电泳显示RNA分子是否降解。 260 nm /280 nm光吸收比值 取10μL 总RNA样品，加1000μL DEPC处理过的水，混匀，测同一样品在260nm和280nm光吸收值，以A260 / A280 的比值表示其纯度，比值在1.8-2.0之间为纯的RNA，比值低于1.8，说明RNA样品有蛋白质或酚的污染，需要用氯仿重新抽提。 2. RNA含量 RNA浓度（μg/ml