基因工程的基本操作答案.ppt

1.2基因工程的基本操作程序 基本步骤 一、目的基因的获取 二、基因表达载体的构建 三、将目的基因导入受体细胞 四、目的基因的检测与鉴定 一、目的基因的获取 (一)、目的基因 目的基因主要指能编码蛋白质的基因，例如，与生物抗逆性相关的基因、与优良品质相关的基因、与生物药物和保健品相关的基因等，也可以是一些具有调控作用的因子。 基因结构：原核生物基因与真核生物基因在结构上都有编码区和非编码区。 编码区：是编码具有一定氨基酸序列的蛋白质的序列。 非编码区：分布于编码区两侧，对于编码区编码蛋白质具有 调控作用。 原核生物基因---编码区连续 真核生物基因---编码区不连续 外显子与内含子的认识： (二)、获取目的基因的方法 1.从基因文库中获取目的基因 (1)基因文库：将某种生物全部DNA提取出来，选用适当的限制酶，将DNA切成一定范围大小的DNA片段，分别与载体连接，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。 (2)种类：基因组文库：这个受体菌的群体包含了这种生物的所有基因，称 为基因组文库。 部分基因文库：部分受体菌所含有的基因只是该种生物的部分基 因，称为基因组文库。如cDNA文库。 两种文库的比较 基因文库类型 部分(cDNA)文库 基因组文库 构建基因文库 的过程 某种生物某个时期的mRNA 逆转录 cDNA 与载体连接导入 受体菌群体 某生物内部全部DNA 限制酶 许多DNA片段 与载体连接导入 受体菌群体 文库大小 小 大 基因中启动子 无 有 基因中内含子 无 有 基因多少 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因 物种间的基因交流 可以 部分基因可以 (3)从基因文库中获取目的基因的主要依据 可根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA、基因的翻译产物蛋白质等特性来获取目的基因。 获取目的基因的途径 从供体细胞的DNA中直接分离。方法：鸟枪法。 鸟枪法：供体的DNA切成许多DNA片段，连入载 体导入受体细胞，根据性状筛选目的基因 人工合成(真核细胞) 反转录法：mRNA→单链DNA→双链DNA 根据已知氨基酸序列合成DNA 方法：氨基酸序列推测mRNA序列，mRNA序 列推测基因序列，化学合成目的基因。 2.利用PCR技术扩增目的基因 (1)PCR：PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过这一技术，可以获得大量的目的基因。 (2)原理：利用DNA双链复制的原理。 (3)前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列(以便根据这一段序列合成引物)。 (4)需要条件：模板DNA、引物、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶(Taq酶)、PCR扩增仪。 (5)特点：呈指数式扩增 (6)过程： 引物结合到互补DNA链 Taq酶从引物起始进行互补链的合成 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 延伸方向：从5’端向3’端延伸 (7)细胞内DNA复制与PCR技术的比较 细胞内DNA复制 PCR技术 不 同 点 场所 主要在细胞核内 生物体外 解旋 在解旋酶作用下，边解旋边复制 不需解旋酶。高温(90℃~95℃)解旋， 双链完全分开 酶 DNA解旋酶、DNA聚合酶 Taq酶 引物 不需要 需要 温度 体内温和条件 高温 相 同 点 ?需提供DNA复制的模板； ?四种脱氧核苷酸为原料； ?子链延伸的方向都是从5’端到3’端 3.人工合成 如果基因较小，核苷酸序列又已知，也可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。 二、基因表达载体的构建 基因表达载体的构建是基因工程的第二步，也是基因工程的核心。 1.目的：是目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。 2.组成：