聚丙烯酰胺凝胶电泳课题.pptVIP

第三章 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE） Polyacrylamide Gels Electrophoresis 第 一 节 引 言 催化剂 Acr + Bis PAG PAGE的特点： 第二节 聚丙烯酰胺凝胶 一、 聚丙烯酰胺凝胶的结构及用量计算 胶的纯度与毒性 PAG的浓度与交联度 a/b 10 PAG 易碎、坚硬、不透明 a/b 100 PAG 稀糊状 a2%, b0.5% 胶不发生聚合 a/b ≈ 30 (a3%) PAG 富有弹性、透明 经验公式：T= 5 ~ 30%, C=6.5 – 0.3T 二、聚丙烯酰胺凝胶的聚合过程 化 学 聚 合 AP+TEMED Acr + Bis PAG 特点 光 学 聚 合 VB2+TEMED Acr + Bis PAG 特点 三、聚丙烯酰胺凝胶的孔径 与分子筛效应 T 增加 胶孔径 变小 T 不变，C = 5% 时，胶孔径 最小 分子筛效应 第三节 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）的机理 一、不连续体系（Disk – PAGE） pH、胶浓度（孔径）、缓冲液成分、电位梯度 二、 三大效应： 浓缩(堆集)效应 分子筛效应 电荷效应 [ P ] = [ L ] 9.3 x 10-3 [ P ] 样品被堆积的浓度 [ L ] 前导离子的浓度 样品被堆积的浓度与原样品的浓度无关。 样品被堆积的程度与原样品的浓度有关。 第四节 缓冲溶液选择的原则 碱 性 体 系 第五节 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）的方法 一、仪器设备 电泳仪： 恒压、恒流、恒功率 电泳槽：（带恒温和不带恒温） 圆盘、垂直平板、水平平板 恒温冷却系统： 冷却水外循环、半导体制冷 凝胶图像处理系统： 电泳结果照相、定性、定量、分子量、等电点测定等。 二、 实 验 步 骤 制胶 （配胶、脱气、灌胶、封水） 连续体系、不连续体系、化学、光学聚合 加样 （加指示染料 碱性：溴酚蓝，酸性：甲基绿） 样品盐浓度要低、不含不溶物质 电泳 电流、电压、温度、时间、 取胶 染色 、脱色（蛋白质、核酸） 非专一染色：考马斯亮蓝、银染、荧光染料 专一染色：糖蛋白、脂蛋白、同工酶 分析 电泳结果照相、定性、定量、分子量 电泳相对迁移率 染色区带移动距离 x 染色前凝胶的长度 Rm = 指示染料移动的距离 x 染色后凝胶的长度 第六节 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）的应用 一 、 对蛋白质的分析 蛋白质成分、纯度、活性物质 定性、定量 二、对核酸的分析 常用大孔胶(胶强度问题） 尽可能去除 protein（吸附问题） 可采用甲酰胺非水体系（构像问题） 三、制 备 电 泳 * * 引发剂： AP, VB2 加速剂： TEMED } pH8.9 小孔 } pH6.7 大孔 pH8.3 Tris-Gly { Tris-HCl + - } pH8.9 小孔 } pH6.7 大孔 pH8.3 Tris-Gly { Tris-HCl + - Tris : pK 8.1 Gly: pKa1=2.34 pKa2=9.8 pI= 5.97 } pH4.3 小孔 } pH6.8 大孔 pH4.5 HAc- β-ala { HAc-KCl - + HAc : pK 4.8 β-ala: pKa1=3.68 pI= 7 酸 性 体 系 *