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交联于蛋膜上的纳米颗粒增强的尿酸酶传感器 陈燕花 化工与资源环境学院 化学工程与工艺专业 指导教师：伍 林 1前言 随着生命科学的发展进入分子水平，有人预言21世纪将是检验医学的世纪，即从分子水平对疾病进行诊断和治疗。这就要求临床生物化学检验准确、快速、简便标本微量化方法标准化且经济实用。生物传感器跨领域学科的前沿。生物传感器领域紧贴当液中的尿酸通过酶膜时，酶进行反应检测出产生的反应电流，然后将其换算成尿酸浓度加以显示。应用尿酸酶测定血和尿中尿酸的浓度，准确、快速、简便帮助诊断肾炎、白血病和肿瘤等疾病 图1尿酸在尿酸酶作用下的反应机理 Figure1 Principle of uric acid under the uricase 3 实验部分 3.1 仪器与试剂 试剂：尿酸酶（4.6units/mg， Sigma公司），牛血清白蛋白（BR），戊二醛（CP），磷酸氢二钠，磷酸二氢钾（AR），氯化钠(AR)，鸡蛋，气透膜，实验用水为二次蒸馏水。 仪器：玻碳电极（天津兰力天仪器有限公司），铂电极（自制，铂片长×宽×厚为5×4×0.25mm），甘汞电极（上海雷磁），CHI600型电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)。 3.2 尿酸酶电极的制备 取新鲜鸡蛋壳小心剥离蛋膜，依次用NaCl溶液、蒸馏水清洗；称取12.5mg牛血清白蛋白（BSA）溶于250μL 10g?L-1尿酸酶溶液中；将蛋膜铺于洁净的玻片上，小心裁取直径为1cm的圆形膜；在膜上依次滴加25μL尿酸酶-牛血清白蛋白混合溶液、改性纳米二氧化硅凝胶液、5μL 2%戊二醛溶液，室温放置3~4h，置4℃冰箱冷藏过夜；过夜后的蛋膜用磷酸缓冲液(PBS)漂洗数次；将酶膜紧贴于PB修饰的玻碳电极表面，覆盖气透膜，即制成尿酸酶电极[5,6]。 实验流程如图2所示。 图2 纳米颗粒增强的尿酸酶电极制作示意图 Figure2 Manufacture flow chart of nanoparticles strengthen uricase electrode 3.3 实验方法 采用三电极进行检测饱和甘汞电极为参比电极，酶电极为工作电极底液为0.1mol的KCl 磷酸盐缓冲溶液，温度测量时先将三电极置于缓冲溶液中，加一电压于工作电极(0.4ＶvsSCE)当背景电流值减小至一恒定值时，将电极放至被测溶液中，分别记录不同时间的电流响应值，扣除初始背景电流值即为被测离子浓度的电极电流响应值。使得电极响应与浓度成很好的线性关系 图3酶电极在不同浓度的尿酸中的循环伏安图 图4尿酸浓度与响应电流线性关系图 Fig3 Cyclic voltammograms of the uricase biosensor Fig4 Linear relationship’ chart of difference of urate standard in different concentration of uric acid current response solutions on the urate biosensor (a.112.5μg/mL, b.75μg/mL, c.37.5μg/mL, d.7.5μg/mL, e.0μg/mL) 4.2 尿酸酶浓度的影响 向溶液中多次酶，以测定不同浓度酶对氧化峰电流的影响。电流响应随着酶浓度从到某浓度的增加而增加。综合考虑电流响应和经济因素选择最适宜的酶浓度。把纳米颗粒引人到传感器研究中改性纳米SiO2颗粒对生物分子具有很好的选择吸附性可望实现纳米颗粒与酶分子活性中心及电极之间的直接电化学作用，大大增强生物传感器的灵敏度。pH值对酶催化反应速率和酶的活性有较大影响，酶最适宜pH范围较宽。综合考虑酶的活性以及响应电流的最大的灵敏度，选择最适宜的pH值。 图5 pH值对酶生物传感器响应信号的影响 图6 温度对酶生物传感器响应信号的影响 Fig5 Effect of pH on the current response Fig6 Cyclic voltammograms of the uricase biosensor of the enzyne biosensor in different temperature (a.25℃, b.20℃, c.30℃, d.35℃, e.10℃) 4.5 温度的影响 温度的变化将影响酶的活性及酶催化反应速率。在1035℃范围内考察氧化峰电流与温度的关系。氧化峰电流随温度的升高而增大考虑温度较高时酶易变性失活，选择最适宜的温度。具有操作简