PCR技术用于基因治疗及研究的进展..doc

分 子 生 物 学 课 程 论 文 题 目 PCR技术用于基因治疗及研究的进展 班 别 学号 姓 名 成 绩 PCR技术用于基因治疗及研究的进展 摘要 PCR技术与分子克隆和DNA序列分析方法几乎构成了整个现代分子生物学的实验工作基础。PCR技术使微量的核酸（DNA或RNA）操作变得简单易行，同时还可使核酸研究脱离活体生物。PCR技术的发明是分子生物学的一项革命，极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展。[1]本文综述了在基因研究方面的。1953年沃森（Watson）与克里克（Crick）提出的DNA结构模型。 1958年Meselson和Stahl利用氮标记技术在大肠杆菌中首 次证实了DNA的半保留复制55%的线性DNA模板，常规PCR的变性条件是94~950C变性为45s。当模板DNA的G+C含量＞55%时要用更高的变性温度。 （二）退火 退火是引物和模板DNA复性。复性过程采取的温度（Ta）至关重要。复性温度过高，引物不能与模板很好地复性，扩增效率很低。复性温度太低，引物将产生非特异性复性，导致非特异性的DNA片段的扩增。虽然退火温度可以通过理论计算出来，但没一个公式适用于所有长度和不同序列的寡核苷酸引物。最好在比两条寡核酸引物的熔解温度低2~100C范围内进行系列预实验来对复性条件进行优化，或者通过控制PCR仪在连续的循环中逐渐降低的复性温度来确定最佳退火温度。一般来说，退火温度通常在比理论计算的引物和模板的熔解温度低3~50C的条件进行 （三）延伸 即寡核苷酸引物的延长，通常在热稳定DNA聚合酶催化DNA合成的最合适温度下进行。对于TaqDNA聚合酶，最适温度一般为72~780C；在这一温度，TaqDNA聚合酶的聚合速率为2000bq/min。 （四）循环数目 PCR扩增所需的循环数取决于反应体系中起始的模板拷贝数以及引物延伸和扩散的效率。一旦PCR反应进入几何级数增长期，反应会一直进行下去，直至某一成分成为限制因素。对于TaqDNA聚合酶，在一个含有105个拷贝的靶序列的反应体系中进行30次循环后就能达到上述的理想情况。 PCR技术的应用 （1） 遗传性疾病的基因诊断 一般按一下几种方式进行：1根据特异性扩增带缺失做出诊断；2根据RFLP（限制酶片多段长度多态性）连锁分析作出诊断；3根据寡核苷探针斑点杂交进行基因诊断。临床上常用于家族性的遗传病、产前胎儿性别及伴随性遗传病的诊断。[5] 1988年Chamberlain首次将多重PCR应用于杜氏肌营养不良症（Ducenne muscular dystrophy ,DMD）的检测，后来用于Becker型肌营养不良症的检测。1969 年Newton等最早提出了用等位基因特异PCR（allele_specific PCR）检测人抗胰岛素基因缺陷。缺口PCR（gap PCR）可用于地中海贫血的筛查。PCR还广泛应用于怀孕早期诊断，防止有遗传性疾病婴儿出生，有利于优生优育，提高人口质量。 用于传染和流行病的检查 PCR在临床上的应用主要是检测病原体，包括患者是否受到某种病原体的感染，食物中各种病原体的含量是否超标。有多种PCR方法可以用来检测病原体，原则上讲凡是已知有特异标记的病原体都可用PCR进行鉴定。可用PCR检测的病原体包括各种细菌、病毒、沙眼衣原体、支原体、寄生虫等。 AIDS病由人免疫缺陷病毒HIV感染所致获得性免疫缺陷综合症。HIV-1是一个多态性RNA反转录病毒。该病毒感染细胞后依靠自身的反转录酶反转录为相应的DNA并整合到宿主细胞染色体上，以此为基础进行复制。在计算机的帮助下针对保守性很强的序列设计出一些引物。通过PCR技术就可以早期查出是否已感染AIDS病毒，包括去年发生的SARS病毒。[3] 在肿瘤研究中的应用 PCR也已广泛应用于肿瘤的病因与发病机制研究以及肿瘤诊断与治疗的研究。例如，用差异显示PCR能针对不同肿瘤寻找其特异而敏感的标志物。用于早期诊断、判断预后及疗效评估。化学治疗，放射治疗和骨髓移植使癌症患者的存活率明显提高，不过，复发的分先仍然是完全治愈的显著障碍。这样，用定量PCR检测微量小残留病灶成为进一步改进治疗水平上出现的反应作出治疗决定。癌症的起因最终也可归结于单个细胞的子的改变，从而引起细胞的正常生理发生改变，导致细胞的异常繁殖。单细胞PCR能找到单个细胞内的分子改变情况，从而促进对肿瘤的病因及发病机制的研究。 在基因分型中的应用 序列特异性寡核苷酸多态性PC