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请用简短的话语（2-3句话）写出与本委托项目的区别： 本计划主要是针对直接找出并抑制胰脏癌依赖的自体吞噬miRNA, 并设计表达质体, 通过瞬时和稳定转染至胰脏癌细胞后观察最有效抑制胰脏癌细胞生长的标的miRNA, 结合药厂设计成新一代抑制胰脏癌的标靶药物 本委托项目查新点：（1）利用芯片找出特异性Micro RNA阻断自体吞噬mRNA的转译，并使其快速降解，减少胰脏癌细胞内的表达，降低细胞存活率，达到治愈。 （2）Micro RNA是长度在21-23个核苷酸之间的单链RNA片段，调节基因的表达。Micro RNA由基因编码，从DNA转录而来， 但不翻译成蛋白。我们将找出的几个与自体吞噬相关的特定 Micro RNA先殖入细胞中观察细胞生长情形，再找出抑制胰脏癌细胞效果最佳的Micro RNA。 （3）我们将此段Micro RNA殖入特定的质体当中，形成自体吞噬特异性的质体DNA。再将此质体DNA转殖进入胰脏癌细胞中使其稳定表达以控制mRNA的翻译和稳定性来抑制胰脏癌细胞利用自体吞噬生存之特性。 1.ARHI基因诱导胰腺癌细胞系PANC-1自噬作用及其相关机制初探. 丁辉. 北京协和医学院. 博士. 2010； 摘要：胰腺癌是死亡率最高的恶性肿瘤之一,目前临床多种治疗措施未能显著延长胰腺癌患者生存期。深入了解胰腺癌细胞增殖、生长、程序性细胞死亡、迁移等异常生物学行为及其分子机制,是寻找更有效的肿瘤干预措施、提高胰腺癌治疗效果的重要手段。 近年来研究发现自噬现象与肿瘤关系密切,多种抑癌基因可诱导自噬。诱导或抑制自噬都可能成为有效的肿瘤治疗措施,但需要根据肿瘤发展的不同阶段、不同的肿瘤类型选择诱导或抑制自噬。 ARHI基因是1999年发现的一个母源性印迹基因,是Ras超家族成员之一,也是小分子G蛋白的一种,但GTP酶活性低。其编码的蛋白在人类多种组织中表达。与大部分Ras家族成员是癌基因和促生长调控因子不同,研究证实ARHI基因在卵巢癌和乳腺癌中是抑癌基因,可以抑制肿瘤细胞增殖和迁移,过表达可促进细胞凋亡。新近研究发现,抑癌基因ARHI近似生理水平再表达可诱导多种人卵巢癌细胞系自噬性细胞死亡,而不是凋亡。 我们实验室的前期研究表明,ARHI基因在胰腺癌组织中也发挥抑癌基因的作用。通过瞬时和稳定转染将ARHI基因导入该基因表达缺失的胰腺癌细胞,发现ARHI抑制胰腺癌细胞系的增殖,诱导胰腺癌细胞死亡,稳定转染ARHI可导致胰腺癌细胞周期停滞。 ARHI是否诱导胰腺癌细胞自噬目前尚未见报道,本课题在前期研究的基础上探讨ARHI基因瞬时表达是否诱导胰腺癌细胞系PANC-1发生自噬,并初步探讨其可能机制。 一、抑癌基因ARHI对胰腺癌细胞系PANC-1自噬的影响 目的：探讨ARHI基因再表达是否促进胰腺癌细胞系PANC-1自噬 方法：应用本实验室构建的携带ARHI基因编码序列的pIRES2-EGFP-ARHI质粒,采用脂质体法瞬时转染胰腺癌细胞系PANC-1,用荧光显微镜及流式细胞术验证转染效率,用RT-PCR及western blot验证ARHI基因转录及翻译水平表达情况；采用Hoechst33258染色观察凋亡细胞形态,PI染色流式细胞术检测细胞凋亡率；应用吖啶橙染色观察细胞内嗜酸性自噬溶酶体,透射电镜观察细胞内具有双层膜结构的自噬体。 结果：1)瞬时转染48小时ARHI组PANC-1细胞可见ARHI基因mRNA表达,而空载体组及正常PANC-1细胞组无ARHI mRNA表达。ARHI组瞬时转染后48小时和72小时可见ARHI蛋白表达,空载体组无ARHI蛋白表达；2)转染后120小时Hoechst33258染色ARHI组及空载体组均可见凋亡细胞核及凋亡小体,正常PANC-1细胞未见明显凋亡征象；3)转染后120小时PI染色,流式细胞仪检测凋亡率,ARHI组细胞凋亡率(29.6±8.4)%,高于空载体组(23.4±6.8)%,但差异不具有显著性(P0.05)；4)转染后72小时吖啶橙染色,可见ARHI组细胞内亮红色自噬溶酶体(9.3%)明显高于空载体组(0.4%),差异具有显著性(P0.05)；通过透射电镜证实了吖啶橙染色结果：ARHI基因瞬时转染PANC-1细胞72小时透射电镜可见典型自噬体,空载体转染组未见自噬体。 小结：1)ARHI基因瞬时转染组细胞凋亡率高于空载体转染组,但差异无显著型；2)ARHI再表达可诱导胰腺癌细胞系PANC-1发生自噬。 二、抑癌基因ARHI诱导胰腺癌细胞系PANC-1自噬的相关机制初探 目的：探讨ARHI再表达诱导PANC-1细胞系自噬的可能机制。 方法：ARHI基因瞬时转染PANC-1细胞48小时、72小时后分别提取细胞总蛋白,western blot检测ARHI组及空载体组pERK、pAKT、AKT