细胞内DNA的显示课件.pptVIP

细胞内DNA的显示 实验原理 实验方法及步骤 实验结果及注意事项 作业 1.实验目的 1 了解原位显示细胞内ＤＮＡ成分的一般原理和方法． ２　了解细胞内ＤＮＡ的一般分布状况． 2.实验原理 核酸是最重要的生物大分子之一，它和蛋白质一起构成生命的主要物质基础。核酸的最主要的生物学功能是它直接参与生物遗传信息的传递过程.在真核细胞中DNA主要分布在细胞核中,并与蛋白质结合核蛋白,构成染色质(体)的主要成分.在线粒体和叶绿体中也有少量DNA存在。 根据核酸三种成分的不同特性,可用不同方法加以显示。核酸的碱基具有共轭双键,具有吸收紫外光的性质,其吸收高在260波长处,因此,可有紫外吸收法对核酸进行定量测定。核酸的戊糖部分经稀酸水解后生成醛，可与Schiff氏试剂生成特异性的反应.这就是显示DNA的传统细胞化学方法Feulgen反应。 Feulgen反应的机理:用稀酸水解DNA,首先破坏糖键,然后破坏糖和嘌呤碱之间的苷键,从而暴露出脱氧核糖化合物,通过磷酸键被连结在核糖主键中,稳定地保持着呋喃糖的形式,并在脱氧核糖的一端(C)形成游离的醛残基,像醛一样可以和Schiff氏试剂(无色品红亚硫酸)结合,形成紫红色化合物,所以只有DNA的部位,才能呈现紫红色阳性反应。 如果稀酸水解DNA继续进行,则会使蛋白质和核酸进一步被去除。所以过度水解会使Schiff氏试剂的染色深度下降,甚至使反应呈阴性。 2.实验方法及步骤 ⑴固定:鹌鹑(或蟾蜍)血涂片 ↓室温干燥 正常反应片 对照片 ↓ ↓90℃三氯醋酸15min ↓ 蒸馏水略洗 ↓ ↓ ⑵稀酸水解:1mol/L盐酸 ↓冷3 min 1mol/L盐酸 ↓60℃水浴5-12 min 1mol/L盐酸 ↓冷略洗 ⑶染色: Schiff氏试剂 ↓暗盒避光30 min 2.实验方法及步骤 ⑶染色: Schiff氏试剂 ↓暗盒避光30min 亚硫酸水I,II,III ↓各3 min ⑷水洗:流水冲洗 ↓2 min 蒸馏水 ↓略洗 镜检 Feulgen反应的结果及应注意的问题 Feulgen反应的结果：由于DNA主要分布在细胞核,所以经Schiff氏试剂反应着色后,细胞核呈现深紫红色,而细胞的其它部分无色.如用亮绿复染,则细胞质和核仁呈现浅绿色。 Feulgen反应应注意的问题： 　　⑴做对照实验为了检验Feulgen反应的阳性的可靠程度,最好用DNA酶消化细胞材料,取得Feulgen阴性反应作为对照.如果没有DNA酶,也可以用5%三氯醋酸抽提核酸作为阴性反应对照。 　　⑵稀酸水解的时间: Feulgen反应的一个关键步骤是水解DNA,使其释放出游离的醛残基,但水解时间要适宜。若水解时间不够,嘌呤碱脱落不下来,反应就变弱;反之,若水解时间过长,则可使DNA和蛋白质过度降解,使反应变弱,甚至呈阴性反应。 稀酸水解的时间一般为5-15 min,随动植物种类以及固定剂的不同而异。 　　⑶ Schiff氏试剂的质量: Schiff氏试剂的好坏直接影响着DNA的呈色反应,所以应选用质量好的碱性品红来配制Schiff氏试剂,并注意避光保存,防止氧化变红失效。 作 业 绘图表示鹌鹑血细胞中DNA的分布。 简述Feulgen反应的原理及关键步骤。 * * 返回大纲 返回 返回 返回