菌株鉴定流程总结.docVIP

学习总结 各位领导好，从5月25号开始，在周老师的实验室已经进行了十多天的培训，让我学到很多。现将我在实验室学习的情况总结汇报。 一、细菌鉴定流程： 表观观察鉴定： 培养24h的菌落观察，如：菌落形态（圆形、椭圆形等）、大小（直径多少）、表面光滑度（光滑和粗糙）和隆起情况（扁平，隆起，凸起等）、边缘整齐、菌落的透明度、菌落（菌落颜色及是否产生色素等）及培养基的颜色（培养基是否变色）等菌落的描述。 显微观察，观察单个菌的形态（杆状，圆形，椭圆形，螺旋形等），是否有芽孢，荚膜的情况。 染色观察，革兰氏染色、芽孢染色、荚膜染色。 分子鉴定： 细菌DNA的提取（试剂盒法） 将菌种接在适宜的液体培养基中，进行液体发酵，180rpm/min，24h培养。 将摇瓶发酵的菌液加到1.5ml离心管中，10000rpm离心1min，倒掉上清液。 向菌体沉淀中加入200ul缓冲液GA，震荡，至菌体悬浮。如果是革兰氏阳性菌，则向菌体中加入120ul的Tris盐酸缓冲液，再加入80ul溶菌酶，37℃，30min以上。 向离心管中加入20ul蛋白酶K溶液，混匀。 加入220ul缓冲液GB，震荡15s，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。 加入220ul无水乙醇，充分震荡混匀15s，可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个离心柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 向吸附柱CB3中加入500ul缓冲液GD，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 向吸附柱CB3中加入600ul漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 重复操作步骤⑼。 将吸附柱CB3放入收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间部位悬空滴加50-200ul洗脱缓冲液TE（或ddhH2O），室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，-20℃保存。 PCR扩增和电泳检测 细菌扩增引物（16SRrDNA）为： 27F：5-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT-3； 1492R：5-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3。 扩增体系： 10 x buffer 5μl dNTP 4μl Mg2+ 3μl 引物1 1μl 引物2 1μl Taq酶 0.4μl 模板 2μl 双蒸水 33.6μl 总体积 50μl PCR的扩增条件： Lid temp ：99℃ 预变性温度：95℃ 5min 变性温度 ：94℃ 1min 退火温度 ：58℃ 30s 延伸温度 ：72℃ 90s 最后延伸 ：72℃ 10min 保温 ：4℃ ∞ 电泳凝胶检测：基因组的在2.3kb处，扩增引物在1.5kb处，如在23kb和1.5kb处出现亮条带，则操作成功。 送去测序（华大基因测序和博尚生物测序） DNA分子拼接，由测序公司拼接或者自己用DNAMAN拼接 在NCBI上进行核苷酸序列比对以及用MEGA软件构建系统发育树。 生理生化鉴定 根据分子鉴定的结果（已鉴定到属），对照常见细菌鉴定手册进行生理生化的鉴定。 常规生理生化的鉴定： 糖醇类发酵，产酸产气 一般细菌以休和利夫森二氏培养基，芽孢菌用芽孢菌专用培养基或用休和利夫森二氏培养基进行培养观察。葡萄糖以被测1%糖、醇代替。主要包括：D-葡萄糖、乳糖、半乳糖（麦芽糖替代）、蔗糖、D-甘露醇、肌醇、D-山梨醇、D-木糖、D-果糖、甘油。 以幼龄斜面培养物穿刺接种于上述培养基，适温培养，1，3，5天后观察，如指示剂变黄，表示产酸，为阳性;不变或变蓝则为阴性。 甲基红、V.P测定 甲基红（M.R）和V.P测定的实验使用相同的培养基，甲基红测定是在培养2、6天时滴加一滴甲基红试剂观察颜色变化，红色为阳性，黄色为阴性。V.P测定同甲基红相同，只是加入的试剂不同，V.P测定是加入肌酸来鉴定的，反应10min，培养基中有红色出现为阳性，有时需放置更长的时间。 吲哚实验 使用1﹪胰胨水溶液培养基，在培养1,2,4,7天的培养液中加入3～5mm高的吲哚试剂于培养基表面，在液层界面发生红色为阳性。若颜色不明显，可加入4～5滴乙醚至培养液，摇动，静置片刻，再加入吲哚试剂。 明胶、淀粉的水解 将加入明胶的培养基分装于试管中，灭菌，穿刺接种，20℃培养2，7,10,14和30天。在20℃以下的室温观察生长情况和明胶