人肝素结合性表皮细胞的构建与鉴定..doc

合肥师范学院本科毕业论文（设计）开题报告 （学生填写） 学号 1211451054 姓名 黄思玉 指导教师 陈金武 题目 人肝素结合性表皮生长因子原核表达质粒的构建与鉴定 课题内容： 一、选题依据 1、本课题的目的及意义 作为表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)家族成员之一的肝素结合性表皮生长因子( heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor ,HB-EGF )可参与囊胚的着床 , 骨骼肌的发育，心肌的分化 ,肾小管的形成, 伤口处或缺血/再灌注损伤后的组织修复和肿瘤的形成[1]。本实验通过构建人肝素结合性表皮生长因子高效重组载体，将重组表达质粒转化进入大肠杆菌中，经TPTG诱导后目的基因表达产生大量高纯度的人肝素表皮结合性生长因子。 所以研究人肝素结合性表皮生长因子对于心肌的分化，肾小管的形成，以及骨骼肌的发育等方面都有重要的作用，我们从细胞中提取目的基因入手，接着对目的基因进行扩增，并构建重组质粒，导入到大肠杆菌中进行检测与表达。从而得到更好的表达质粒，使其可以表达出纯度更高的人肝素结合性表皮生长因子，这对于医学研究和科学研究都有重要的意义。 国内外的发展状况 肝素结合样表皮生长因子(Heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor，HB-EGF) 1988 年 Bester 等在人巨噬细胞培养液中发现的。可由巨噬细胞、平滑肌细胞和血管内皮细胞等分泌产生[2]。在人类和动物的多种组织中均有分布，如皮肤、肺、骨骼肌和中枢神经系统，具有广泛的生物学作用[3]。它是分子量为 20-22KD的单链蛋白质，其基因位于人类第五号染色体上，是近年来发现的表皮生长因子 (epidermal growth factor, EGF)家族中的成员之一，其生物活性与 EGF 类似，但促细胞分裂活性较 EGF 强，因其与肝素有较强亲和性而得名[4]，与 EGF 家族中其它因子一样，都是主要通过与 EGF 受体结合后发挥生物学作用。HB-EGF 前体为跨膜蛋白分子 (pro HB-EGF)，降解后产生游离 HB-EGF(s HB-EGF)，pro HB-EGF 可促进邻近细胞的增殖并抑制其凋亡[5]。s HB-EGF 是许多细胞的有丝分裂原，包括角质形成细胞、平滑肌细胞、上皮细胞等。近年来研究发现 HB-EGF 与生殖内分泌有极其密切的关系，在子宫内膜、早孕绒毛及蜕膜组织中有表达[6]，可促进子宫内膜生长、分化，在介导胚泡的黏附与着床、维持胎盘的功能方面起着非常重要的作用。目前有许多研究已经证明 HB-EGF 参与骨骼肌发育、心肌分化、肾小管形成、伤口处或缺血再灌注损伤后的组织修复以及多种肿瘤的形成[7]。 有日本学者发现[8]上皮性卵巢癌患者腹水上清中HB-EGF 浓度明显高于良性卵巢瘤组及正常卵巢组，说明其与卵巢癌发生发展有关。伴随产生的羧基末端，即 HB-EGF-C，从胞浆质膜转移至胞核，与 transcriptional 抑制物前髓细胞性白血病锌指(PLZF)结合[9]。HB-EGF-C 的结合引起胞核 PLZF 输出，允许细胞周期蛋白 A(Cyclin A)表达，通过加速通过 S 期引起细胞周期进展。Christopher Kramer等[10]在对膀胱癌临床标本的研究中发现癌细胞核内 HB-EGF 信号表达增多预示着不良预后[11]。HB-EGF 还可通过 G 蛋白耦联受体配体在 EGFR 转活过程中起关键作用[12]，这些受体包括透明质酸，内皮素-1 和血管紧张素-Ⅱ等。 二、研究目标和内容 1、研究目标 本实验的研究对象为人肝素结合性表皮生长因子，我们从细胞中提取目的基因入手，接着对目的基因进行扩增，并构建重组质粒，导入到大肠杆菌中进行检测与表达，从而得到更好的表达质粒，使其可以表达出纯度更高的人肝素结合性表皮生长因子。 2、研究内容 通过从细胞中提取出mRNA逆转录出cDNA。 （2）引物与cDNA结合，并通过PCR进行扩增。 （3）得到扩增后的目的基因，通过T4连接酶与表达质粒连接。 （4）然后导入到大肠杆菌中进行双酶切检测，观察其是否可以表达。 三、课题关键问题及难点： 1、关键问题 （1） 通过查找文献找出培养载有人肝素结合性表皮生长因子的细胞和最适条件。 （2） mRNA的制备，cDNA第一链的合成，cDNA第二链的合成，cDNA与接头连接及载体连接，质粒的转化。 （3） PCR扩增要具有特异性，高效性和忠实性。 （4） 进行连接反应时通过设置不同梯度的保温时间和温度使连接条件最优化。 （5） 酶切鉴定时关键要控制好影响限制性内切酶活