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实用电子显微镜技术 测试中心 陈义芳 2010年 第一节 电子显微镜发展简史 一、国外电子显微镜生产简况 1932年德国物理学家Knoll和Ruska研制成功第一台透射电子显微镜。 20世纪80年代末，商品透射电子显微镜普遍进入市场。 电镜厂家：日本日立（Hitachi）公司 日本电子光学实验室（JEOL) 荷兰菲利浦公司（Philips）（即美国FEI公司） 德国蔡司（Zeiss）公司 捷克 英国剑桥 二、国内电子显微镜生产简况 1959中国科学院长春光学精密机械与物理研究所研制成功第一台透射电子显微镜 10万倍 100kv 重大科学技术成果 1975中国科学院北京科学仪器厂研制成功第一台扫描电子显微镜 电镜厂家：中国科学院北京科学仪器厂研制中心 上海电子光学技术研究所 南京光学仪器厂 三、电子显微镜的发展 分辨率进一步提高，点分辨率优于0.3nm，晶格分辨率0.1-0.2nm 放大倍数从十几倍提高到几十万甚至百万倍 种类不断增加，功能不断扩展。（TEM、SEM、STEM、分析电子显微镜、高压透射电子显微镜、低温透射电子显微镜等） 计算机技术开始用于电子显微镜 第二节 电子显微镜技术的发展与应用 一、电子显微镜技术的发展 第一台电子显微镜问世后，面临的首要问题是如何将电子显微镜技术应用于生物学及其他学科研究。 电子显微镜结构的改进和功能的改善，样品制备技术的改进，使电子显微镜技术在生命科学研究中发挥了重要作用。 表1-2 电子显微镜技术发展简史 二、电子显微镜技术的应用 样品制备方法主要包括：超薄切片、负染色、金属投影、冷冻复型、快速冷冻深度蚀刻技术、免疫电子显微镜术、扫描电镜常规样品制备及扫描电镜冷冻断裂技术等。 利用多种样品制备方法和高性能的电子显微镜，在生命科学领域可以观察到细胞中各种细胞器的超微结构，并以此进一步研究细胞结构与功能的关系，深入探索细胞通讯与运输、分裂与分化、增殖与调控等生命活动的规律。在农林科学方面，电镜技术对植物各种疾病病因诊断与防治的研究越来越重要。利用电镜技术观察高分子、表面活性剂、碳纳米管及纳米粒子等结构形态，为化学及材料科学研究提供了有力的技术手段。 第三节 其他显微技术的发展 扫描隧道显微技术(STM) 原子力显微技术(AFM) 激光扫描共焦显微技术 扫描隧道显微技术(STM) 原子力显微技术(AFM) 激光扫描共焦显微技术 扫描隧道显微技术(STM) 原子力显微技术(AFM) 激光扫描共焦显微技术 第一章 超薄切片技术 透射电镜的生物样品制备的常用方法包括超薄切片、冷冻复型、负染色等。透射电镜靠电子束穿透样品成像，对样品厚度有很高要求。超薄切片方法得到的样品切片厚度为60-100nm，冷冻复型膜厚度约为30nm。复型膜制备和样品负染色的实验过程简单、易于操作，而制备超薄切片的过程则比较繁杂。它分为普通超薄切片技术和冷冻超薄切片技术两大类。 第一节 普通超薄切片技术 普通超薄切片技术：不需要特殊的冷冻条件的常规包埋切片技术。包括：取材、固定、清洗、脱水、浸透、包埋、聚合、切片及染色等步骤。每一步都关系到实验成功与否，需步步谨慎认真。 具体步骤： 取材——醛类固定液前固定几小时或更长时间——0.1MPBS清洗数次——1%锇酸后固定2h或过夜——0.1MPBS清洗数次——梯度乙醇或丙酮脱水（30％、50％、70％、80％、90％、95％、100％、100％）——浸透（1：1、1：2、纯包埋剂）——包埋——聚合（37℃12h、60℃ 48h）——超薄切片——染色（双重染色） 对超薄切片的基本要求 为了获得清晰的电镜图像，超薄切片应达到以下几点要求： （1）细胞的超微结构得到良好的保存，没有人工假象； （2）切片厚度一般为50-70nm左右，较薄的切片分辨率较高，但反差较弱，而较厚的切片反差虽好，但分辨率则稍差； （3）切片的包埋介质不变形、不分解、不升华，可耐受电子束的照射； （4）切片平展均匀，没有刀痕、皱褶、震颤及染色剂的沉淀污染； （5）切片染色后，具有良好的反差并可获得清晰的图像 第二节 制样前的准备工作 一 实验设计的准备 二 实验器具和实验试剂的准备 三 实验材料的准备