免疫组织化学论述.pptVIP

为应用免疫组织化学技术显示细胞组织内的某种化学成分，必须制备这种物质的相应抗体。首先需从细胞组织内将有关物质提取出来作为抗原，再利用所提取的抗原制备特异性抗体。 细胞组织内进行的抗原－体反应在显微镜下很难直接看到，还需要对抗体进行标记，使抗原－抗体复合物呈色以便于光镜观察，或增加复合物密度便于电镜观察。所谓抗体标记技术，即利用荧光素或酶或重金属颗粒使之结合于抗体分子上。 利用双价或多价结合力的物质，如植物血凝素、生物素－亲和素等，一方面与标记物（如荧光素、酶等）结合，另一方面又可与细胞组织内某种物质（如抗体）结合，这种利用一种物质对组织内某一成分亲和能力发展起来的技术，即称亲和免疫组织化学（affinity immunohisto-chemistry）。 4．铁蛋白标记 铁蛋白（ferritin）是一种含铁（占23％）的球形蛋白质，直径11～13nm。抗体与铁蛋白可通过低分子量的双功能试剂（如戊二醛）的结合，形成双分子复合物，既保留抗体的免疫活性，又有致密铁离子核心可用于电镜观察。 5．荧光素标记 荧光素即产生荧光的染料，常用的有异硫氰酸荧光素（FITC）和罗丹明。用已知的抗原或抗体标记上荧光素，用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测细胞或组织内的相应抗原（或抗体），由于抗原抗体复合物上含有荧光素，可在荧光显微镜下观察。 13）流水冲洗。 14）需要时可复染细胞核。 15）脱水、透明、封固。 抗生物素分子有 4个相同的亚基，是生物素结合的位点，这也就可以与带有生物素分子的大多数蛋白质相结合，因而就能使抗生物素和生物素标记的酶之间形成大分子复合物， ABC在这种复合物中过氧化物酶活性并不受影响。 八、包理后金标抗体法 （1）超薄切片载于镍网。 （2）在10％H2O2内蚀刻15min。 （3）双蒸水洗3次，每次10min。 （4）镍网浸于5％正常羊血清10min。 （5）滤纸吸干，孵育于第一抗体，室温2h或4℃过夜。 （6）TBS洗3次。 （7）0.1％BSA-TBS液（pH8.2）洗5min。 （8）金标第二抗体1:30～1:100，室温10min～1h。 （9）0.1％BSA-TBS洗3次。 （10）TBS洗5min。 （11）l％戊二醛后固定10min。 （12）双蒸水洗3次。 （13）5％乙酸铀及柠檬酸铅复染各5min，每次染后双蒸水洗。 （14）电镜观察。 结果为：第一张切片一物种的特异性抗血清已先与切片上靶抗原结合，后加的另一物种的抗体不能再与靶抗原结合，故呈阴性结果。第二张切片因先加的正常血清对靶抗原无封闭作用，再滴加特异性抗体后进行免疫染色，仍呈阳性结果。 （2）胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4％，取0.4g胃蛋白酶溶于0.1mol／L HCl内即可。消化时间为37℃，30～180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：层粘连蛋白，IV型胶原等。 2.化学修复法 （1）皂素：一般使用浓度为2～10 μg/ml的溶液，消化时间为室温孵育30分钟。 （2）尿素：3mol／L，37℃消化5min。主要用于单克隆抗体免疫染色的石蜡切片。 3.热修复法 （1）石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，3％H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟×3。将切片放入盛有0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）的容器中，置微波炉内加热，使容器内液体温度保持在92～98℃之间并持续10～15分钟。取出容器，室温冷却10～20分钟。 注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型。 PBS洗，下接免疫组化染色步骤。 （2）石蜡切片高压抗原修复操作方法：切片脱蜡至水。将1500～3000ml的枸橼酸盐缓冲液注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。 当压力锅开始慢慢喷气时（约加热5～6分钟后），计时1～2分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗 2分钟×3，下接免疫组化染色步骤。 （3）石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作法：切片脱蜡至水后，放入盛有枸橼酸盐缓冲液的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达92～98℃起开始计时15～20分钟，然后端离电炉，室温冷却20～30分钟，蒸馏水冲洗，PBS洗，下接免疫组化染色步骤。 八、染色对照 1．阳性对照 用已知含有靶抗原的组织切片与待测切片（或者将二者贴于同一载玻片上）