0203-司庆刚-产中性蛋白酶芽孢细菌的筛选-20102917.docVIP

产中性蛋白酶芽孢细菌的筛选 司庆刚 （山东农业大学，生命科学学院，2010级生物工程3班 ,泰安 ） 摘要：目的：豆豉中可以产生中性蛋白酶菌株，因此培养高产菌株，进行保藏，为进一步研究开发提供依据。[1]方法：将豆豉样品进行预处理分离其中所产生的细菌，用酪蛋白平板法进行初步筛选活性较高的菌株，进行斜面菌种保藏。保藏一段时间后在紫外线下进行诱变育种。[2][3]通过酶活测定的比较，可以筛选出活性高的诱变菌株。[4][5] [6][7]结果：筛选出一株高产蛋白酶的菌株进行保藏。 关键词：芽孢细菌、酶活测定 1. 目的意义： 1.通过酶活测定筛选出一株高产中性蛋白酶的芽孢细菌菌株。 2.学习掌握酶活测定的基本方法。 [9][10] 2. 材料方法： 2.1.1 实验材料 已加工的豆豉样品 2.1.2 实验试剂 6mol/L NaOH，1mol/L HCl，干酪素，酵母膏，琼脂，蒸馏水，蛋白胨，氯化钠，葡萄糖，碳酸钠(42.4g/L)，福林试剂，酪氨酸（100μg/mL））））5.0g； 酵母膏：2.0 g；琼脂：20.0g； 蒸馏水：1000ml pH: 7.0 LB分离纯化固体培养基 ：蛋白胨：10.0g； 酵母膏：5.0 g； 氯化钠：10.0g；琼脂：20.0g； 蒸馏水：1000ml pH到 7.0 LB斜面保藏固体培养基（同纯化培养基） LB活化培养基（同纯化培养基，琼脂除外） 发酵培养基 ：葡萄糖：2.5g；蛋白胨：5.0g；酵母膏：2.5g；氯化钠：2.5g；蒸馏水：1000mL；pH到7.0 2.2.1 材料准备 配制牛奶筛选固体培养基5瓶，每瓶200mL；3瓶无菌水，每瓶45mL；21支无菌水试管，每支9mL；LB固体培养基两瓶，每瓶200mL；LB斜面14支，每支5mL；包好的平板等放入高压灭菌锅进行灭菌，121℃，20分钟 LB活化培养基2瓶，每瓶100mL；配制酪蛋白筛选固体培养基7瓶，每瓶200mL；1瓶生理盐水，100mL；44支无菌水试管，每管9mL；LB斜面20支，每支5mL；包好的平板放入高压灭菌锅进行灭菌，121℃，20分钟 LB活化培养基4瓶，每瓶50mL；发酵培养基4瓶，每瓶50mL； 2.2.2 产蛋白酶细菌的初筛 取3份样品每份5g分别加入到装有45mL无菌水的三角瓶中，80℃恒温水浴锅预处理10min。将样品处理液进行梯度稀释，得到3组10-1 ~ 10-7稀释度的稀释液。分别取0.1mL10-3 ~10-7稀释度的稀释液涂布于酪蛋白培养基平板上[4],每组每个梯度涂3个平板，37℃恒温培养48h。挑取具有明显蛋白水解圈的菌落于LB平板上进行划线分离纯化，每个菌种6个平板,37℃恒温培养24h，取单菌落经斜面培养每个单菌落7支管，培养长满菌苔后于4℃冰箱中保存。 2.2.3 蛋白酶产生菌株的紫外诱变 2.2.3.1诱变菌悬液的制备 将诱变出发菌接入液体发酵培养基，37℃，8000r/min，离心5min，弃上清[5]，加入无菌生理盐水，重新振荡悬浮菌体，再离心，弃上清，最后制成5mL菌悬液，用血球计数板在显微镜下直接计数，逐步添加生理盐水调整细胞浓度为108/mL,取诱变前的菌悬液进行10-1-10-7稀释分离，取10-5、10-6、10-7三个稀释梯度[6]，每一梯度取100μl菌液涂布平板，37℃倒置培养24h。 2.2.3.2紫外诱变 将每1mL菌悬液置于9cm的无菌培养皿中，将待处理的培养皿置于超净工作台中，培养皿距离20W紫外灯的距离为30cm左右，轻轻摇匀后打开皿盖[7]，分别处理1min、2min、3min，照射完毕后先盖上皿盖，再关闭紫外灯；取1mL处理后的菌液进行10-1 -10-5梯度稀释分离，取其中的10-3、10-4、10-5三个稀释度各取100μl菌液涂布平板，用黑色包装包好37℃倒置培养（避光培养）。诱变过程在暗室红灯下进行，当长至合适大小时，进行平板菌落计数，计算致死率。观察菌落水解圈大小，挑取水解圈较大的菌于4℃冰箱进行菌种保藏 2.2.4 液体发酵复筛 2.2.4.1标准曲线的制备 参照《GB/T 23527-2009 蛋白酶制剂》，进行标准曲线的制备： 2.2.4.2液体的活化及发酵 将4株菌接入活化培养基活化16小时后，将活化好的菌液按照2％接种量，接种至发酵培养基中，37℃，180rpm摇床振荡培养，分别取24h、48h发酵液测定其酶活。 2.2.4.3酶活的测定 3 数据结果 3.1 菌落与水解圈直径测量 经过酪蛋白平板的筛选,根据菌落大小跟水解蛋白透明圈大小比值从样品中初步分离得到5株产蛋白酶的细菌。并发现10-6梯度为计数适宜浓度。结果如下表: 菌落直径（D/mm）