03.培养液的组成和制备1课件.ppt

第三章 教学目的和要求 掌握培养液的基本成分、血清细胞培养液 掌握平衡盐溶液的组成、作用 一、培养液的基本成分 提供尽可能与体内生活条件相接近的培养环境，包括10个因素： （1）温度 （2）渗透压 （3）氢离子浓度 （4）其他有机离子（5）主要的代谢物 （6）补充的代谢物 （7）激素 （8）影响细胞代谢的其他因子 （9）细胞生长的基质 （10）各因素间的相互作用。 早期：大多是完全天然成分：血清、血浆、胚胎浸出液等。接近体内状态，但组成成分复杂，未知因素比较多。 目前：人工培养液。但一般仍加5~10%血清，未知因素仍然存在，尽可能通过人工控制，减少血清等天然成分，作成低血清或无血清培养液。 4、粘度：血清的存在，直接影响培养液粘度。 粘度对细胞生长影响较少，但在细胞培养或用胰蛋白酶处理时，为尽量减少 细胞损伤，可通过提高培养液粘度来克服。 加羧甲基纤维素 或 聚乙烯吡咯烷酮 来增加粘度，这对低或无血清尤为重要。 5、表面张力和泡沫 表面张力有利于培养物粘着与底物上面。 在悬浮培养中，减少泡沫的产生，加防泡沫硅。 三、天然培养基 包括体液、组织提取液。 如：血清、血浆、鸡胚浸出液、水解乳蛋白、 胶原等。 （三）鼠尾胶原 胶原是细胞生长的良好基质，对组织和细胞固定附着、改善生长表面的特性有很好的作用。 胶原来源： 大鼠尾腱、豚鼠真皮、牛的真皮、牛眼的水晶体等。 实验室常用大鼠尾制胶原。 粘度大，难以滤过除菌，应无菌操作制备胶原。 四、合成培养基 合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基 ，如：TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM、Ham，sF12等。每种培养基都有其特定的目的。但一般都适用于多种细胞的培养。 1、主要成分是：氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。 2、合成培养基（液）的配制方法： 人工合成培养基是细胞培养基的基础培养液 -------------------“基础培养基” 因它提供细胞生存所需的营养成分。又叫 “细胞营养液”。 有干粉型、1倍工作液型、10倍浓缩型。 配制时：按说明书配制，完全溶解，并在消毒和保存中不产生沉淀 。 （一）基础培养基 常用的基础培养基有MEM、NT、M199、F12、DMEM、IMDM、RPMI-1640等。各种培养基常以1：1混合。 补加：Hepes 15 mmol / L，Na HCO4 1.2~2.4 g / L。 缺点：培养细胞对外界刺激耐受性较差。 蒸馏水：三蒸。 最后一次蒸馏应在配制前制备后，立即使用。 （二）补充、附加成分 多数无血清培养液必须补加3~8种因子，至少要2种，已知有100多种此类因子，有些是必需补充因子， 如：胰岛素、硒酸钠、 转铁蛋白等。 4、微量元素 Se、Cd、Vit A、Vi t E 等 Se有抗氧化、增强其它因子的作用。 5、酶抑制剂 避免残余酶对细胞损害。 大豆胰酶抑制剂：0.1~0.5%+DMEM / F 12培养液中，滤过除菌。-200C （一）胰蛋白酶液 胰蛋白酶主要来自牛、猪胰脏，黄白色粉末，易潮解。 1、机理：除去细胞间的粘蛋白、糖蛋白。影响细胞 骨架，使细胞分离。 2、作用浓度：0.25%，0.125%。 3、最适条件： 370C，PH7.4，无Ca++，Mg++，血清、蛋白质。 因这些物质能降低其活力。 所以，配制用无Ca2+，Mg2+的D-Hanks液配制酶液。 细胞一旦分散，可用血清培养液、胰酶抑制液来终止其作用。 九、0.2M L-谷氨酰胺 L-谷氨酰氨 2.9222克（M=146.15）加适量500C三蒸水溶解，定容至100ml，滤过除菌，1ml / 安瓿，- 200C保存。 使用时，每100ml 培养基加1ml谷氨酰氨。 （一）氢、链霉素（双抗）液 母液： 链霉素：100万u/10ml 三蒸水（或Hanks液） =10万u/ml。 青霉素：80万u/8ml 三蒸水（或Hanks液） = 10万u/ml 。 使用时： 0.1ml母液×10万u/ml/100ml培养基 =100u / ml 。 （二）卡那霉素 母液： 50000ug / 瓶 / 5ml Hanks = 10000ug / ml 使用时： 0.5ml母液×10000ug / ml / 100ml 培养基=50ug / ml。