0404_动物细胞大规模培养方法及其应用课件.pptVIP

Vero细胞和狂犬病毒的培养工艺 DMEM培养基 胎牛血清 其他成分 锥形瓶逐级放大培养 加碱（碳酸氢钠） 加糖（葡萄糖） 灌注培养液 微载体 5L种子罐培养 培养液 50L 生 物 反 应 器 接种狂犬 病毒 出液口 收获病毒 动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等 大规模动物细胞培养的问题及对策 1、优化细胞培养环境 2、改变细胞特性 3、提高产品的产率 1、细胞培养环境 细胞培养环境中抑制因素的积聚是提高细胞密度的主要限制因素。 体外动物细胞培养中氨离子的积累是抑制细胞生长的主要因素之一。氨的积聚使细胞内UDP氨基己糖(UDP-N-乙酰葡糖胺和UDP-N-乙酰半乳糖胺)增加，影响细胞的生长及蛋白的糖基化过程。 2、细胞死亡与凋亡 在大规模动物细胞培养条件下，细胞凋亡/死亡多是在营养成分耗尽、有毒代谢产物增多时发生。因此一种“细胞静止”过程可以有效降低营养成分消耗和代谢毒物产生，提高CHO细胞的目的蛋白产率。 方法是向CHO细胞中导入p21、p27的基因，使细胞周期中G1期延长(细胞静止)，改造后，细胞活力正常，外源基因表达蛋白量提高。其优点是产品成本降低，产量提高，遗传一致性高。 3、培养基与细胞系 无血清培养基成为当今细胞培养领域研究的一大课题。无血清培养基的优势在于避免了血清的批次、质量、成分等对细胞培养造成的污染、毒性作用和不利于产品纯化等不良影响。 在生产疫苗、单抗和各种生物活性蛋白等生物制品的应用领域中，优化无血清培养基的成分可使不同的细胞在最有利于细胞生长和表达目的产物的环境中维持高密度培养。但无血清培养基并不适用于广泛的细胞类型，不同类型的细胞甚至不同的细胞系或细胞株都有可能有各自的无血清培养基构成。 4、过程监控 大规模动物细胞培养中由于大量细胞的代谢，细胞培养环境迅速改变，在线过程监控更为重要。 动物细胞大规模培养技术失建立在贴壁培养法和悬浮培养法基础上，再融合了固定化细胞、填充床、生物反应器技术以及人工灌流等技术而发展起来的。 主要包括： 悬浮培养 微载体培养 微囊化培养 中空纤维法 利用大规模培养哺乳类细胞是一项重要的生产生物制品的技术，包括疫苗、干扰素、激素、生长因子和单抗等，具有很高的经济和社会效益。 1、悬浮培养 动物细胞的悬浮培养是在微生物发酵的基础上发展起来的。动物细胞没有细胞壁保护，不能耐受剧烈的搅拌和通气。 对于小规程培养多采用转瓶和滚瓶培养，大规模培养多采用发酵罐式的细胞培养反应器。 悬浮培养，设备结构简单，有成熟的理论计算，可以借鉴微生物发酵的部分经验，放大效应小。 但是悬浮培养的细胞密度较低，转化细胞悬浮培养有潜在致癌危险，培养病毒易失去病毒标记而降低免疫强力。此外，有许多动物细胞属于贴壁依赖性的，不能悬浮培养。 悬浮培养的关键是要选择适当的搅拌和通气装置. 2、微载体培养系统 贴壁依赖性动物细胞的培养，最初是采用滚瓶系统，其结构简单、投资少，技术成熟，重现性好，放大只是简单地增加该瓶数。但是，滚瓶系统劳动强度大，单位体积提供细胞生长的表面积小。为了克服这些不利因素，1967年，van wezell开发了微载体系统培养贴壁依赖性细胞。微载体是直径为60~250μ m的微珠。采用微裁体系统培养动物细胞，细胞贻壁于微载体上，微载体(和细胞)悬浮于培养基中，细胞在微载体表面逐渐生长成单层。 1967年，Van Wezel开发了微载体系统培养贴壁细胞。 微载体是直径60-250μm的微珠。多用带不同基团的葡聚糖交联成几种大分子，使其带有适当电荷或介质，以利于细胞的贴壁及生长。 这种模式，把单层培养和悬浮培养的优点融汇在一起，具有两种培养方法的优点。 1) 表面积／体积比大 2) 由于微裁体悬浮于培养基中，是均匀悬浮 培养，简化了细胞生长各种环境因素的监测和控制。 3) 培养基利用率高。 4) 采样重演性好。 5）收获过程不复杂。 6) 放大较容易。 7) 劳动强度小，占用空间小 与微载体结合的生物反应器系统 收获细胞 接种——球传球 3、包埋培养 悬浮生长和对贴壁依赖生长的细胞都适用，细胞生长的密度高，抗剪切力和抗污染能力强。对悬浮生长的细胞用海藻酸钙包埋，对贴壁依赖生长细胞用胶原包埋。由于动物细胞培养慢而费有高，且对剪切力敏感， 经包埋后可有效的保护细胞。 4、微囊化培养 在动物细胞微囊化的制备中，主要是应用海藻酸—聚氨基酸的方法，简单过程是动物细胞与海藻酸溶液混合搅拌，经过微囊发生器将微球滴入氯化钙溶液中，形成凝胶，然后再用聚氨基酸