2-2核酸提取及常见问题分析OK课件.ppt

核酸提取及常见问题分析 内容 前言 DNA提取的几种方法 DNA提取的几种方法 基因组DNA－ CTAB法 基因组DNA－ CTAB法 基因组DNA－ CTAB法 基因组DNA－ CTAB法 基因组DNA－SDS法 基因组DNA－SDS法 基因组DNA－其它方法 　物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法 　化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法 　生物方式：酶法 基因组DNA－其它方法 　吸附材料结合法： 基因组DNA－其它方法 　浓盐法： 　　　　　　 　 　有机溶剂抽提法： 　　　　 　 　密度梯度离心法： 　　　　　　　 质粒DNA－碱裂解法 质粒DNA－碱裂解法 质粒DNA－煮沸法 细胞器DNA－差速离心法 内容 DNA提取的基本步骤 材料准备 细胞裂解 核酸分离、纯化 核酸分离、纯化 核酸分离、纯化 核酸分离、纯化 核酸沉淀、溶解 DNA提取常见问题 DNA提取常见问题 DNA提取常见问题 内容 RNA提取的通用方法 RNA提取的通用方法 影响RNA提取的因素 影响RNA提取的因素 内容 RNA提取常见问题 RNA降解 RNA降解 OD260 /OD280 比值偏低 OD260 /OD280 比值偏低 电泳带型异常 下游实验效果不佳 RT常见问题分析和解决方案 RT常见问题分析和解决方案 RT常见问题分析和解决方案 作业 实验材料不佳或量少 破壁或裂解不充分 沉淀不完全 洗涤时DNA丢失 尽量选用新鲜（幼嫩）的材料 动植物要匀浆研磨充分；G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁 高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量） 低温沉淀，延长沉淀时间 加辅助物，促进沉淀 洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒 问题三：DNA提取量少。 对 策 原因 第一部分：DNA提取方法简介 第二部分：DNA提取常见问题、 　　　　　原因分析及其对策 第三部分：RNA提取方法简介 第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策 第三部分：RNA提取方法简介 RNA提取的通用方法 　异硫氰酸胍/苯酚法 原理： 细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放； 释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离； 有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA。 　异硫氰酸胍/苯酚法 步骤: 材料准备：尽量新鲜。 裂解变性：异硫氰酸胍（亚硫氢胍，巯基乙醇，N-月桂肌氨酸等）。 使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNA，有效抑制核酸酶。 纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除杂物。 洗涤：70％乙醇。 沉淀：异丙醇、无水乙醇。 乙酸钠（pH4.0）：维持变性的细胞裂解液的pH值，沉淀RNA。 此外还常用氯化锂选择沉淀RNA。 影响RNA提取的因素 材料： 新鲜，切忌使用反复冻融的材料 如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮存在TRIzol或样品贮存液中，于－70℃或－20℃保存 如要多次提取，请分成多份保存 液氮长期保存，－70℃短期保存 影响RNA提取的因素 样品破碎及裂解： 根据不同材料选择不同的处理方法： 培养细胞：通常可直接加裂解液裂解 酵母和细菌：一般TRIzol可直接裂解，对于一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁 动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，样品保持冷冻 样品量适当，保证充分裂解 为减少DNA污染，可适当加大裂解液的用量 纯化： 在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速； 经典的纯化方法，如 LiCl 沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易造成 RNA 降解； 柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响 RNA 后续酶反应的杂质，是目前较为理想的选择。 影响RNA提取的因素 第一部分：DNA提取方法简介 第二部分：DNA提取常见问题、 　　　　　原因分析及其对策 第三部分：RNA提取方法简介 第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策 第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策 RNA 的降解 OD260 /OD280 比值偏低 电泳带型异常 下游实验效果不佳 新鲜细胞或组织： 裂解液的质量 外源RNase的污染 裂解液的用量不足 组织裂解不充分 另外某些富含内源酶的样品 (如脾脏，胸腺等)，很难避免 RNA 的降解。 建议在液氮条件下将组织碾碎，