5蛋白组学-定量蛋白质组学课件.pptVIP

二维电泳荧光检测 Red Cy3 Green Cy5 DIGE gel images of normal and cancer cells. A, Cy2 image of proteins from normal cells; B, Cy5 image of proteins from tumor cells 染料 Cy2 Cy3 Cy5 分子量Da 550.60 582.77 580.75 给蛋白质增加的质量Da 434 466 464 荧光颜色 蓝 绿 红 最大吸收波长（nm） 491 553 645 最大发射波长（nm） 509 569 644 三种荧光标记试剂（花青染料）的物理性质 注意事项 蛋白质的被标记量控制在较低的标记率以便每个蛋白质分子只含有一个标记荧光分子。 加入内标增加分析的可靠性。 胶点的蛋白质离开荧光成像扫描仪后不可见，因此对胶点要进行定位。 * * * * * * 除了荧光染料的优势外，2d-dige还将内标的概念引入了双向电泳图谱的分析中。。。。 Siver vs. dige Sensitivity Range Spots number Time Money Statistics in DIGE 1. The importance of an internal standard 2. DIA Normalization; BVA Normalization 3. Statistics T-test (independent or paired) The Student’s T-test is used to test the hypothesis that a variable differs between two groups. ANOVA (one-way, two-way) The One-Way ANOVA evaluates differences in all assigned groups, whereas the Two-Way ANOVA can also evaluate the statistical significance of effects from independent factors (such as time, temperature and dose). d0/d4标记37＃点，进行MS分析 37＃点：两个蛋白 一个蛋白量上没有变化（*） 一个蛋白在条件限制培养基中表达增加，1:3 Lys上-NH2特异标记方法：MCAT O-甲基异脲(O-methylisourea)可以选择性地胍基化Lys残基上的ε-NH2 。 不标记N末端的NH2和其它残基侧链。 “质量标记的丰度标签”(Mass-Coded Abundance Tagging，MCAT)的标记策略。 每标记上一个胍基，片段分子量增加42Da。 MCAT策略流程：定性 Lys只在Trypsin酶切后的末端，所以产生的b离子都没有被修饰；所有的y离子带Lys，因此被修饰。 在MS/MS图谱上，所有的b离子是单一条带出现，所有的y离子是成对出现，丰度比例一样，且相差同样的m/z。 容易区分b离子和y离子，容易读出氨基酸序列。 MCAT策略流程：定量 将来源不同样品的裂解物进行标记或不标记，然后等量混合，经LC分离，在MS图谱上就可分析不同蛋白量的变化 酵母细胞提取物的离子层析和LC/MS图谱：定性分析 肽段胍基化后分子量增大，在层析图上较晚出现。 肽段的定量分析 肽段被胍基后，分子量增加42Da，但是带2个电荷，m/z相差21个单位 通过离子交换层析图谱上峰的面积，可以计算两种肽段的相对量 0.88 : 1 MCAT优点 O-甲基异脲(O-methylisourea)对Lys残基ε-NH2的胍基化程度可以进行量上的控制 增加的质量（每个胍基42 Da）可以很容易在MS上检测到 ε-NH2的胍基化修饰并不影响肽段的离子化和带电荷程度 –COOH羧基标记 通过对羧基酯化进行标记 用H和D标记的甲醇酯化标记，来定量研究蛋白质表达量的差异 羧基酯化标记进行蛋白定量研究 比例＝2 : 1 缺点： 特异性不是很好，在C末端和Asp和Glu残基上都有标记，且效率不均 采用的标记条件容易引起天冬酰胺(Asn)和谷氨酰胺(Gln)的去酰胺 –COOH羧基标记 在H218O的溶液中进行蛋白酶切，从而特异性的只在C末端引入稳定的同位素标记 这类蛋白水解酶只在肽段的-COOH端引入一个18O 这类蛋白水解酶只在肽段的-COOH端引入二个18O 标记后的肽段在质谱上的分离 18O进行蛋白质组的标记和定量 -SH在标记反应中的作用 Cys残基上的-SH基团更具有标记反应的特异性 ，如烷