chap9.4糖的研究方法课件.pptVIP

第九章 糖链研究方法 §9.4 糖复合物生物功能研究方法 糖链的功能需要进行体内研究 许多缺乏糖基转移酶或糖苷酶的细胞系在体外并未表现出明显的表型，而在体内却能引发病理改变和在某些情况下导致胚胎死亡。 哪些方法可以用来造成糖复合物中糖链的改变进而观察其生物功能改变？ 糖链缺失/增加 糖链上的糖基改变 糖链末端糖基缺失/增加 糖复合物中糖链功能的研究方法 糖复合物生物功能研究方法（1） 1）利用糖基化过程不同的天然突变细胞株 可将细胞用化学（如烷化剂）、物理（如电离辐射）或生物（如病毒转染）方法进行处理，使细胞发生诱变。 可使用凝集素（细胞毒性或导致细胞黏附）抗性、辐射自杀、影印铺板等方法筛选突变体。 常缺失或过表达糖链合成加工中的某一或是某些糖基转移酶或糖苷水解酶。 但糖链加工的缺陷有时不完全或不专一。 可以在体外研究细胞粘附，分子识别和蛋白质折叠、分拣等。但对于糖链在胚胎发育和分化中的作用研究有局限性。 影印铺板法筛选突变体细胞 N-糖基化过程有关的细胞突变株 糖基供体（糖核苷酸）的合成和转运缺陷 糖基转移酶的动力学性质或细胞定位改变 新的糖基转移酶被活化 GPI锚生物合成的突变体 蛋白聚糖组装中的突变体 糖脂和粘蛋白组装中的突变体 … 糖核苷酸合成和转运中的细胞突变株 糖基转移酶的动力学性质或细胞定位改变 新的糖基转移酶被活化 糖复合物生物功能研究方法（2） 应用内切和外切糖苷酶 内切糖苷酶 PNG酶（肽N聚糖酶）：GlcNAc—GlcNAc—Asn 内切酶H、CII、D、F：GlcNAc—GlcNAc—Asn POG酶：GalNAc—Ser/Thr 外切糖苷酶： 神经氨酸酶；α、β半乳糖苷酶；β-N-乙酰氨基己糖酶；α、β甘露糖苷酶；α岩藻糖苷酶等。 有严格的立体专一性和键专一性。但也有一些酶没有严格的键专一性。 糖苷酶法的问题 天然糖蛋白很难被完全酶解； 糖链去除可能导致改变蛋白质空间构象，不一定就是糖链本身的功能。 糖复合物生物功能研究方法（3） 3）DNA定点突变技术，改变蛋白质糖基化位点： 以相同电荷或极性的氨基酸取代，如Asn→Gln，Ser→Cys，一般不会引起蛋白质构象的变化。对糖链的缺失有选择性。但不能研究单个糖基的作用。 4）糖基转移酶基因敲除或封闭，或基因过表达： 利用转基因技术将外源DNA导入生殖细胞或ES细胞，进行基因knock-out, knock-in or knock-down，研究转基因小鼠的发育和表型变化。 可研究单个糖基的功能。 Approaches to altering glycosylation in studies of oligosaccharide function 糖复合物生物功能研究方法（4） 5）利用自发突变的人类和动物模型 动物的缺陷主要影响蛋白聚糖的生物合成，因为这些缺陷引发的不良形态容易识别。 多种溶酶体贮积异常的突变。 多种CDGS疾病个体 糖基化途径自发异常引发的疾病举例 糖复合物生物功能研究方法（5） 6）应用糖链合成或加工抑制剂 衣霉素（Tunicamycin）：既有尿苷、酰化葡萄糖样结构，又有长链脂肪酸，和G寡糖合成起始反应的两个底物有结构相似，因此可抑制G寡糖合成的起始反应，进而也抑制了蛋白质的N-糖基化。 但对糖蛋白和糖基化位点无选择性，也可能影响糖蛋白的空间构象。 糖合成抑制剂的种类 代谢抑制剂 布莱飞尔定A(Brefeldin A):引起邻近反式高尔基体网内的高尔基体组分逆向运输 氯酸盐作为硫酸盐的类似物竞争性结合硫酸化酶而干扰GAG的合成 … 植物碱：糖苷酶的天然抑制剂 植物碱通过抑制参与形成N-糖链的糖苷酶而抑制N-糖链的后加工过程。通常不干扰蛋白质折叠。 合成的底物结构类似物作为糖基转移酶抑制剂 糖苷引物 Xylβ-O-R可以有效穿越质膜，进入糖基转移酶所在的高尔基体，通过使GAG连接到外源添加的Xylβ-O-R而不是内源核心蛋白，从而抑制GAG与核心蛋白组装为蛋白聚糖。 其它已发现的糖苷引物包括β葡萄糖苷、β半乳糖苷、β-GlcNAc和一些二糖、三糖。 引发作用常常为浓度依赖的表现。不同细胞类型之间效果差别大。 小结 认识糖合成的困难 了解糖合成的进展 了解糖复合物中寡糖链生物功能研究方法的概况 复习N-糖链的合成过程 思考：比较基因功能研究方法与糖链功能研究方法 Glyco-biology 利用糖基化过程不同的天然突变细胞株 用糖苷酶体外修饰造成糖链结构差异 用糖合成抑制剂造成体内糖基化加工的差异 通过定点突变改变糖蛋白的糖基化位点，使糖链增加或缺失 关闭或过表达糖链生物合成必需的糖基转移酶或糖苷酶的基因 利用自发突变的人类或动