分子生物学第五章 分子生物学研究法1课件.ppt

第五章 分子生物学研究方法 1、重组DNA技术发展史上的重大事件 2、DNA操作技术 3、RNA基本操作技术 4、核苷酸序列分析 5·1 重组DNA技术史上的重大事件 半个世纪以来，分子生物学研究主要取得了3大成就: 第一 解决了遗传的物质基础问题－－ 基因的分子载体是DNA; 5·1 重组DNA技术史上的重大事件 第二 DNA分子的双螺旋结构模型和半保 留复制机制，解决了基因的自我 复制和世代交替问题; 5·1 重组DNA技术史上的重大事件 第三 “中心法则”和操纵子学说，成 功地破译了遗传密码，阐明了 遗传信息的流动与表达机制。 5·2 DNA基本操作技术 5·2·1 核酸凝胶电泳技术 1. 基本原理 生物大分子在一定pH条件下，通常会带电荷。将其放置到电场中，就会以一定的速度移向适当的电极。 5·2·1 核酸的凝胶电泳 1. 基本原理 分子在电场作用下的迁移速度与电场强度和电泳分子所带的净电荷数成正比，与分子的摩擦系数成反比。摩擦系数是分子大小、极性及介质粘度的函数。 5·2·1 核酸的凝胶电泳 1. 基本原理 根据分子大小、构型或形状的差异和带净电荷数，可通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离。 2. 琼脂糖凝胶电泳 化学修饰的低熔点琼脂糖(线性多糖聚合物)，在较低温度下便会熔化，冷却凝固便形成良好的电泳介质。常用于DNA片段的电泳制备。 细菌转化：细菌菌株由于捕获了外源DNA导致性状特征发生遗传改变的生命过程。 大肠杆菌是分子生物学家常用的实验材料，也是基因工程重要的实验菌株。 5.2.2 细菌转化与目标DNA分子的增殖 供体菌株、受体菌株、感受态细胞、阳性克隆 细菌转化方法 CaCl2法、电击法（电脉冲）、体外包装法（噬菌体） 大肠杆菌低温(0℃)预处理的低渗氯化钙溶液中，外源DNA粘附在细胞表面，立即将其转到42℃下做短暂的热刺激，外源DNA被细胞所吸收（感受态）。 5·2·3 基因扩增 聚合酶链式反应 　　　即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。它可以在试管中建立反应，经数小时之后，就能将极微量的目的基因或某一特定DNA片段扩增数十万乃至千百万倍。 PCR技术的原理 先将双链DNA分子加热分离成单链，单链DNA模板＋４种dNTP→ DNA聚合酶→新生的DNA互补链。 新合成的DNA链的起点，由加入到反应体系中的一对引物决定的。 PCR反应的全过程 ＰＣＲ反应包括DNA解链(变性)、引物与模板DNA相结合(退火)、DNA合成(延伸)三步，被不断重复。 多次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA数，即两条引物位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值是2n。 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction) 　　 　　　 PCR是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。 【开发史】　　这项技术的发明人是Kary Mullis。1983年，在一家生物高技术公司（Cetus）工作的Mullis着手解决用简单的方法鉴定某一段DNA的技术问题，有一天晚上他驱车在北部加州101号高速公路上，灵机一动想到了一个实际上可以无限扩增某段DNA的简单方法，即PCR。 　　 在1985年的一次学术会议上，此方法首次被介绍，在分子生物科学家中也引起了链反应。大家很快地纷纷采用这个方法，很多人还很奇怪自己怎么没有首先想到这么做。 　 Cetus给了Mullis一万美元的奖金，随后把这项技术的专利以三亿美元的价格转让给另一家生物高技术公司。在短短的几年内，PCR迅速成为分子生物学的一项常规手段，并得到了广泛的实际应用，被许多科学家视为近十年分子生物学领域最重要的一项技术突破。1993年，Mullis因此获得诺贝尔化学奖。 (1)PCR技术简史 核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。 PCR的实现 PCR的改进与完善　 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，其缺点是：①Klenow酶不耐高温， 90℃失活，每次循环都要重新加。②引物链延伸反应在37℃下进行易发生碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。 PCR的改进与完善　 1988年初，Keoha