分子生物学实验方法-2分子生物学课件.ppt

6.5.1 酵母的遗传学和分子生物学简介 酿酒酵母有稳定的单倍体和二倍体细胞。 酵母细胞有三种交配型：MATa, MATα, MATa/α. 两种不同生殖型的酵母（MATa, MATα）可以通过酵母接合的形式，形成二倍体传代 。 MATa/α是二倍体。 野生酵母是原养型的。 6.5.2 酵母基因转化与形状互补 “一步置换法”制备酵母缺失突变体的流程图 “两步置换法”制备酵母缺失突变体的流程图 URA3+ URA3- uridine 不需要 需要 5-FOA 致死 不致死 6.5.3 外源基因在酵母中的功能鉴定 将棉花的ω-6脂肪酸脱氢酶转入酵母中…… 酵母的生理生化特性决定了它适合于动植物基因功能的研究。 6.6 其他分子生物学技术 凝胶滞缓实验 噬菌体展示技术 蛋白质磷酸化分析技术 6.6.1 凝胶滞缓实验 凝胶滞缓试验（gel retardation assay），又叫作DNA迁移率变动试验（DNA mobility shift assay），是用于体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。 在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。如果此时DNA分子与某种蛋白质相结合，那么，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电 极移动的距离也就相应缩短了。 拟南芥转录因子与不同DNA元件有不同的结合能力。 6.6.2 噬菌体展示技术 噬菌体可被分为溶菌周期和溶源周期两种不同的类型。在溶菌周期，噬菌体将其感染的宿主细胞转变成为噬菌体的“制造厂”，产生出大量的子代噬菌体颗粒。实验室常将只具有溶菌生长周期的噬菌体叫作烈性噬菌体。 溶源生长周期是指噬菌体DNA被整合到宿主细胞染色体DNA上，成为它的一个组成部分，感染过程中不产生子代噬菌体颗粒。具有这种溶源周期的噬菌体被称为温和噬菌体。 原理 将编码“诱饵”蛋白的DNA片段插入噬菌体基因组，并使之与噬菌体外壳蛋白编码基因相融合。重组噬菌体侵染宿主细菌后，复制形成大量带有杂合外壳蛋 白的噬菌体颗粒，直接用于捕获靶蛋白库中与 “诱饵”相互作用的蛋白质。 噬菌体展示技术的应用 Light Chain 15aa linker heavy chain TAG PIII amber Phagemids can allow either soluble expression of recombinant protein in bacteria, or the production of the fusion protein encapsulated on the phage tip non-suppressor E.Coli (HB2151) suppressor E.Coli (TG1) STOP glutamic acid 噬菌体抗体库的筛选 6.6.3 蛋白质磷酸化分析技术 由于细胞内可能有多达上千个蛋白激酶，体内检测某个蛋白激酶活性非常困难，科学家常用体外激酶活性分析法来检测蛋白激酶活性。该方法能十分可靠地鉴定某个蛋白激酶对底物的磷酸化作用，筛查激酶的特异性底物。 * 最初以M13噬菌体为载体，宿主菌是大肠杆菌。 缺点 细菌缺乏翻译后修饰系统，真核蛋白不能得到适当地折叠和翻译后修饰，使得该系统筛选到生理作用蛋白的可能性降低。 结构域的引入对目标蛋白的折叠过程或构象可能产生不可预知的影响，从而导致假阳性或假阴性结果。 由于该系统中设计的都是融合蛋白, 因此其特性与单纯的蛋白并不一定精确对应, 这样蛋白质间相互作用的结果可能与真正结果有些误差。 蛋白质芯片( protein microarray) 在固体支持物表面高密度地固定化排列探针蛋白点阵,以特异地捕获样品中的靶蛋白,然后通过检测器对靶蛋白进行定性或定量分析。主要用于进行自动化分析,支持高通量快速筛选。能够同时高效地分析上千种蛋白质间的相互作用,也使得在全基因组水平研究蛋白质的功能(如酶活性、抗体特异性配体、受体交互作用)成为可能。但该项技术的使用受到了蛋白质固定化技术以及载体材料选择的限制,同时也需要复杂昂贵的仪器来对样品进行预处理和检测。 Far-Western? 又叫做亲和印记。将PAGE胶上分离好的几百样品转移到NC膜上，然后检测哪种蛋白能与标记了同位素的诱饵蛋白发生作用，最后显影。缺点是转膜前需要将蛋白复性。 等离子表面共振技术（Surface plasmon resonance）将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面，葡聚糖层固定于几十纳米厚的金属膜表面。当有蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射率上升，从而导致共振角度的改变。而共振角度的改变与该处的蛋白质浓度成线性关系，