第3章 DNA结合蛋白课件.pptVIP

第三章 生物信息的传递 ——从DNA到RNA 第一节 DNA结合蛋白 * * 第一节 DNA结合蛋白 第二节 RNA的转录 第三节 启动子 第四节 终止与抗终止 第五节 原核生物和真核生物mRNA的特征比较 第六节 内含子的剪接、编辑及化学修饰 第三章 生物信息的传递 ——从DNA到RNA 200bp DNA结合蛋白 基因 DNA结合蛋白的结合位点是一个基因的上游序列 一、研究DNA结合蛋白的方法 凝胶阻滞实验(gel retardation) 修饰保护测试(modification assay) 修饰干扰实验（modification interference） 二、DNA结合蛋白质的纯化 亲和层析法 杂交探针法 X-射线衍射晶体分析(X-ray diffraction pattern) 标记DNA片段 标记DNA片段与蛋白质混合物 C1 C2 C3 C4 C5 C6 C1 C2 C3 C4 C5 C6 游离DNA － ＋ 凝胶阻滞电泳 一、研究DNA结合蛋白的方法 修饰保护测试(modification assay) 原理：如果一个DNA分子携带一个结合蛋白，那么该部分核苷酸序列会被保护而不能被修饰。有两种修饰方法： 1.用核酸酶处理，可以裂解除被结合蛋白保护之外的所有磷酸二酯键，通过足迹法进行检测。 ； 2.暴露于甲基化试剂，例如可将甲基加到核苷酸G上形成二甲基硫酸盐，而被结合蛋白所保护的G则不能被甲基化。 DNase I 印迹试验 (DNase I foot printing) 修饰保护测试 (modification assay) 一、研究DNA结合蛋白的方法 修饰干扰实验（modification interference） 原理：如果一个对蛋白质结合起关键作用的核苷酸被改变，例如加一个甲基，则可能会抑制蛋白的结合。修饰剂——二甲基硫酸盐（DMS）。 修饰保护不应与修饰干扰相混淆，后者是蛋白质结合研究中的一种更敏感的技术。 用DMS处理靶DNA，使平均每条链上只有一个G被甲基化。将局部甲基化的DNA与含DNA结合蛋白的细胞提取物共温育后进行凝胶滞缓试验。分离各种DNA条带，并用六氢吡啶切割甲基化的残基。如果因某个G残基的甲基化作用而阻止了蛋白质与DNA的结合，那么，六氢吡啶对这个甲基化G残基的切割作用，就只能在没有蛋白质结合的DNA中观察到。 与蛋白质结合 与蛋白质结合 不能与蛋白质结合 与蛋白质结合的DNA带含有Ⅰ和Ⅲ两种类型的DNA片段 不能与蛋白质结合的DNA带含有全部3种类型的DNA片段 切出所有结合与不结合蛋白质的DNA带,并用六氢吡啶切割甲基化的G残基 缺失的DNA带表明相应G残基的重要意义,它得到结合蛋白质的保护 三、DNA和DNA结合蛋白的相互作用 不同的DNA结合蛋白有广泛的活性，而且调节基因组表达仅是这类蛋白的功能之一。多数参与基因组表达的蛋白质识别特定的DNA序列， 并主要结合在这些靶位点上。尽管具有多样性，但所有的DNA结合蛋白至少都一个共同点，即它们与DNA结合，蛋白质与DNA的结合似乎只有有限的几种方式。 三、DNA和DNA结合蛋白的相互作用 1.参与蛋白质相互作用的DNA 核苷酸序列的直接读取 T A 大沟 小沟 vdW vdW a a a a a d a：氢键受体 d：氢键供体 vdW：范德华力 B型双螺旋A-T碱基对的识别 核苷酸序列对螺旋结构的间接影响 a.DNA双螺旋结构的多态性 b.DNA弯曲（DNA bending） A B Z Mi Ma Ma Mi Mi Ma 三、DNA和DNA结合蛋白的相互作用 大沟宽 小沟窄 小沟窄 大沟不存在 小沟窄而深 大沟变深 小沟宽浅 A B Z Handedness Base Inclination *