AFLP分子标记技术..docVIP

AFLP分子标记技术及其应用 一、什么叫AFLP？ 二、AFLP的基本原理是什么？ 三、AFLP的实验过程怎样？ 四、AFLP的应用研究如何？ 五、对AFLP的评价 分子标记的历史： 第一代分子标记技术 RFLP （Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态性） 第二代分子标记技术 RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA ） AFLP （Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增片断长度多态性） 事实上，还有很多分子标记技术像SSR、ISSR、SRAP（相关序列扩增多态性）另外，还有现在号称为第三代分子标记的SNP（ 单核苷酸多态性) 等 AFLP的基本原理 基因组DNA经两种限制性内切酶酶切，形成分子量大小不等的随机限制性酶切片段，将特定的人工合成的短的双链接头连在这些片段的两端，形成一个带接头的特异片段，通过接头序列和PCR引物3ˊ端选择性碱基的识别，对特异性片段进行预扩增和选择性扩增。最后只有那些两端序列能与选择性碱基配对的限制性酶切片段才能被扩增；最后将选择性扩增产物在高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，寻找多态性扩增片段。 AFLP的实验流程 模板制备 DNA的提取（SDS法和CTAB法） 酶切 连接 PCR扩增(PCR AMPLIFIED ) 预扩增(Pre-amplified) 选择性扩增(Elective amplified) DNA的提取（SDS法和CTAB法） SDS是Sodium dodecyl sulfate的缩写称为十二烷基磺酸钠， CTAB是Cetyl trimethyl ammonium bromide的缩写十六烷基三甲基溴化氨， 两种都是去污剂，它们都能破坏细胞膜使膜蛋白变性沉淀，故而使核酸释放出来，另外，它还能保护DNA不受内源核酸酶的降解。 酶切 为了使酶切片段大小分布均匀，一般采用两个限制性内切酶，一个用6个碱基识别位点的限制性内切酶(常用EcoRI,、PstI或SacI )，另一个用4个碱基识别位点的限制性内切酶(常用MseI 、TaqI)。采用双酶切的主要原因有：(1)多切点酶产生较小的DNA片段，而切数点较少的酶能够减少扩增片段的数目，因为扩增片段主要是多切点酶和切点数较少的酶组合产生的酶切片段，这样就可以减少选择扩增时所需要的选择碱基数。(2)双酶切可以进行单链标记，从而防止形成双链造成的干扰。(3)双酶切可以对扩增片段数进行灵活调节。(4)通过少数引物可产生许多不同的引物组合，从而产生大量的不同的AFLP指纹。这样，经过酶切后就形成了三种类型的酶切片段，如EcoRI/MseI酶切形成EcoRI一EcoRI片段、EcoRI一MseI片段、Mse工一MseI片段，由于AFLP技术革新成功的关键在于DNA的充分酶切，所以对模板质量要求很高，要注意避免其它DNA污染和抑制物质存在。 连接 酶切后的DNA片段在T4 DNA连接酶作用下与两种内切酶相应的特定接头相连接，形成带接头的特异性片段。接头为双链，由两部分组成，一部分是核心序列，一部分是酶特定序列(能与酶切片段粘端互补)，通常在酶特定序列中变换了一个内切酶识别位点的碱基，保证了连接片段不能再被酶切。只有遵循“引物扩增原则”设计的接头才能得到满意的扩增结果。 PCR扩增(PCR AMPLIFIED ) 应用与接头相识别的引物进行扩增。AFLP引物由三部分组成：（1）5′端的与人工接头序列互补的核心序列(core sequence)（2）限制性内切酶特定识别序列(enzyme-specific sequence) （3）3′端的带有选择性碱基的粘性末端(selective extension)，其中AFLP接头的设计(包括核心序列和酶特定序列)是关键之处，常用的多为EcoRI和MseI接头，接头和与接头相邻的酶切片段的碱基序列是引物的结合位点，合成的寡核苷酸接头经过94℃变性，37℃退火，4℃保存备用；理论上每增加一个选择性碱基，将只扩增限制性片段的1/4，而在两个引物上都有三个选择性碱基的情况下，则仅获得1/4096的片段；也就是说，只有那些两端序列能与选择碱基配对的限制酶切片段被扩增。所以选择性碱基是选择用于扩增的特定的限制性片段的一种精确而有效的方法； 预扩增(Pre-amplified) 扩增所用引物3′端有一个选择碱基，通过预扩增对扩增模板进行初步筛选，一方面可以避免直接扩增造成的指纹带型背景拖尾现象，另一方面可以避免直接扩增由引物3′端3个选择碱基误配形成的扩增产物。 选择性扩增(Elective amplified) 预扩增产