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IIF IHC ICC 免疫组织化学标准化 第一部分 基本知识 免疫组织化学的历史、现状和发展 疾病的诊断手段准确性，首推病理诊断准确性高，即病理组织学诊断。更准确、更可信、更有权威性。 1974年免疫组化用于病理诊断免疫组织化学已成为病理诊断中的一种常用手段 随着免疫学和单抗技术的发展，免疫组化技术兴起 诊断免疫组化开始于70年代，发展高峰在80年代， 90年代已在国外病理科列入病理技术室的常规工作。 国内病理科约晚10年的进程，90年代开始在诊断病理工作中普及 免疫组织化学在临床上的应用 (1)提高病理诊断准确性 (2)对疾病的预后和治疗的意义 激素 (3)癌基因蛋白的应用 (4)对肿瘤增生程度的评价 (5)微小病灶的发现 微小癌，微小病灶（如羊水栓塞） (6)在肿瘤分期上的意义 (7)指导肿瘤的治疗 (8)免疫性疾病的辅助诊断 (9)病原微生物的检测 免疫组化与抗体鉴定 抗体上游鉴定方法:存在否?量多少? 免疫印迹、免疫沉淀、免疫电泳、免疫酶连 抗体下游鉴定方法:价值体现 IIF:间接免疫荧光技术,系IF的一种,步骤很简单,特点为敏感性好,对于低浓度抗体检出率高于以下两种方法. IHC:免疫组织化学技术,方法不少,但具体操作基本相同,掌握一种就够用了。 ICC:免疫细胞化学技术,同上，组织换成细胞，但是处理方法不一样了。 下页图示 免疫组化的各种方法 免疫组化实验涉及的几个方面 1 病理医师：把握和选择，指导实验 结果判定， 2 实验员：准备片子和试剂，了解基本原理也很重要，会做也要会分析 3 组织处理 4 试剂是否可靠，实验方法是否正确 5 实验对照设立：许多实验室忽略了这个要素。 第二部分 实验技术 免疫组化染色基本技术 正式实验前做HE染色确认片子质量，厚度3-4um，目的细胞形态完好，没有过多的坏死、出血、变性组织等，以免实验完毕后发现片子质量不好，浪费试剂和物力 1 常规处理：烤片，脱蜡，入水 2 抗原修复： 3 封闭处理：封闭组织内源性酶，封闭组织非特异性抗原结合位点，其他封闭 4 抗体反应：一抗 ，二抗，三抗 5 显色反应：DAB，AEC，BCIP/NBT 6 后续处理：复染/分化 /返兰，脱水，透明，封片 相关知识：HE染色 相关知识：HE 染色 苏木素—伊红染色是形态学常用的染色方法 ，取自 Hematoxyln和Eosin单词，简称HE染色，苏木素将细胞核染成蓝色，伊红将细胞浆染成红色，显示组织和细胞形态结构，同时将各种组织细胞成分与病变区分开来。 HE染色是临床病理诊断的方法。 HE与IHC配合可以确诊疾病 相关知识：HE示意图 相关知识：HE与IHC染色 （一）良好的标本制备，免疫组化成功的首要条件 免疫组化对组织和细胞标本的要求 -保持所检标本原有的结构、形态； -在原位最大程度地保持待测抗原(或抗体)的免疫活性， 既不淬灭、流失或弥散，也不被隐蔽。 免疫组化中常用的组织和细胞标本*组织标本 *细胞标本 石蜡切片 组织印片 冰冻切片 细胞涂片 细胞爬片   *石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法-最大优点是组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；这点对于我们来说非常重要！-石蜡块还能长期存档，供回顾研究。*石蜡切片制作过程对组织内抗原显现有一定的影响，但可通过某些措施予以改善，因而它是大多数免疫组化中首选的组织标本制作方法。 切片的准备：APES，多聚赖胺酸 刚切的石蜡片至少在58-60 ℃考2h以上（防止脱片），可以放置一段时间，实验前再烤30min即可。不可高温烤片（80 ℃ ），会导致组织抗原氧化而难以检测。 切片保存：不可长时间室温或冰箱里保存切片，抗原会丢失，原则上切片最多可放3个月。 背景 ：有些研究人员或技术员喜欢一次性连续切上大量片子，然后放置保存，留做实验 常规的石蜡切片标本均用甲醛（福尔马林）固定，结果使得：-抗原性物质形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇；-蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。 *要求：在染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。 因为石蜡片组织含有石蜡，并且组织处于脱水的状态，所以在实验前期要进行相应处理，即二甲苯脱蜡和梯度酒精水化（从无水乙醇