FACSCalibur分选..docVIP

第六章 FACSCalibur 分选 6．1 分选概述 流式细胞仪流动室中细胞由下至上运动，流动室喷嘴上方有捕获管用于收集细胞。细胞通过激光时，电子系统马上依据分选门的限定判定该细胞是否为目的细胞，如确定，即依照之前用户选定的分选模式分选。一旦决定捕获该目的细胞，电子系统在移动捕获管至样本液流中进行捕获前等待一段固定时间以便让细胞到达捕获部位 。捕获管最大捕获速率为300/秒，不进行细胞分选时，捕获管停留在鞘液中。下图显示了捕获管静止与分选时的位置。由于捕获管等待捕获时停留在鞘液中，它在捕获细胞的同时也收集了鞘液，因此会导致样本稀释，所以收获管必须离心以浓集细胞。 图1 1.1 收集系统 分选后的细胞被收集到50mL收集管中，如图，收集管可以放置在3个收集端口。机器可以自动检测已连接的收集管数目并自动由左（管1）向右注入分选的样本。注满每管（40～45mL）大约需要9分钟。如果在分选结束前收集管被注满，分选会继续，而样本会流入废液罐中。如果你想在收集管注满后继续分选，可以将其换下换上用BSA包被的新管，点击PAUSE , 然后点击START或RESUME。 ?分选液路清洗按钮 你的机器是否有清洗按钮取决于你购买时的选择。如机器配有清洗按钮，按动按钮，机器会自动冲洗分选管路。该按钮用于分选前检测管路是否干净，分选后冲洗管路。 图2 图3 分选模式 分选液滴（sort envelope）是指捕获管捕获一个目的细胞时所收集的那一段样本液流，其大小反映了捕获管捕获细胞时在样本液流中停留的时间。当然，该液滴包含目的细胞，也可能包含非目的细胞，这就产生了矛盾：如果有非目的细胞与目的细胞在一起，捕获管是否该捕获该液滴？由此需引出分选模式，下图显示了不同分选模式下捕获管的分选策略。 图4 分选模式 分选模式的选择依据目的细胞所占的百分比及分选的目的，例如，如果你在分选一个稀少的细胞群你会要求较低的纯度以便获得尽可能多的目的细胞。 可供选择的分选模式有： 单细胞模式（single cell） 只有在分选液滴中仅含有单个目的细胞时才会发生分选，如有其它细胞在液滴中，则该液滴将不被捕获。该模式会有高纯度，不太重视回收率。 回收模式(recovery) 如分选液滴中除含有目的细胞外还含有其它细胞，该液滴仍会捕获。如果另一目的细胞恰巧位于该液滴外，捕获管会在样本液流中继续停留至将其捕获。 排除模式(exclusion) 只有在分选液滴中含有一个目的细胞且不含非目的细胞时分选才会发生。如果另一目的细胞恰巧位于该液滴外，捕获管不会在样本液流中继续停留捕获它。 样本浓度与分选模式的选择 在样本速率为2000粒子/秒时会有最大分选速率，如果一个样本细胞浓度在107细胞/mL，使用低速（LO）即可得到最大分选速率。如样本浓度增加，样本速率增加，反之则减少。如样本速率低于或高于2000细胞/秒则分选速率下降。 有时一个细胞浓度为107个细胞/mL的样本上机后，仍需调节细胞浓度以使分选速率达到2000粒子/秒，这可能是因为流式细胞仪低速并非绝对12μL/秒（LO＝12±2μL/秒），另一个原因可能是血球计数仪不计数红细胞、血小板及碎片等流式细胞仪计数的粒子。 如果你准备分选一个低浓度样本，最好使用2000粒子/秒流速，减少2个细胞同时出现在一个分选液滴中的可能（coincidence），以便在单细胞模式（single cell）获得最大收获率。 与单细胞模式及排除模式不同，回收模式在细胞速率 2000粒子/秒（最高可达2500粒子/秒）时分选速率仍增加，表明未达到300次分选/秒，由于忽略了coincidence，分选纯度将随样本速率的增加而下降，这是由于非目的细胞出现在分选液滴中的可能随样本速率增加而最大。因此在超过单细胞模式最佳样本速率2000粒子/秒时系统仍继续分选。 样本速率对分选速率的影响 理解样本速率对分选速率的影响十分重要，下图显示了单细胞模式下两者的关系。对于不同给定目的细胞百分比的样本，其最大分选速率都出现在样本速率为2000粒子/秒时。例如，对一个含目的细胞60%的样本，在样本流速为2000粒子/秒时出现其最大分选速率－300细胞/秒。 注意：如果