基因工程实验讲义..docxVIP

实验一 已知序列基因的克隆?【实验目的】掌握已知序列基因克隆的原理、流程及操作方法，包括目的基因的分离，与载体的连接，重组DNA的转化及重组子的鉴定。【实验原理】1973年Cohen等人发明了基因克隆技术，其中一项关键技术是重组DNA技术。该技术是用酶学方法，将不同来源的DNA分子在体外进行特异切割、重新连接，组成新的杂合DNA分子。这个杂合分子能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子。基因克隆的路线包括以下几个基本程序：1.分离制备待克隆的外源DNA片段；2.外源DNA及载体的限制性酶切；3.将靶DNA片段与载体连接，组装成杂合DNA 分子；4.重组DNA分子转入宿主细胞；5.筛选重组子；6.目的基因的确认和分析。1．已知序列基因的分离――分对于已知序列的基因主要采用化学合成和生物化学两种方法合成目的基因。化学法是将要合成DNA片段3’端的第一个核苷酸固定于不溶性的载体上，然后核苷酸开始与另一个核苷酸进行缩合反应，不断重复进行。该方法虽然准确性高，但反应速度慢，且合成的成本高、合成的片段小，所以主要用于合成PCR反应的引物。而实验室合成已知序列基因的主要方法是聚合酶链式反应（PCR）技术。在四种脱氧核苷三磷酸（dNTP）存在下，以寡聚核苷酸为引物及单链DNA为模板，经DNA聚合酶催化合成DNA互补链的过程谓之聚合酶链反应。PCR的基本反应步骤和原理：（1）变性：将反应系