研究仙灵骨葆对兔膝骨性关节炎治疗作用.docVIP

研究仙灵骨葆对兔膝骨性关节炎治疗作用　　摘要： [目的]研究仙灵骨葆(xianlinggubao, XLGB)对兔骨性关节炎关节软骨及软骨下骨的保护作用。[方法]30只3个月龄雄性日本大耳白兔，随机分为对照组(Sham)、盐水组(ACLT+NS)和仙灵骨葆组(ACLT+XLGB)，每组各10只。盐水组和仙灵骨葆组行右膝关节前交叉韧带切断术(anterior cruciate ligament transaction, ACLT)造成膝骨性关节炎模型。术后仙灵骨葆组125 mg/(kg·d)灌胃;盐水组则给予等剂量生理盐水。6周后处死动物，取股骨测量骨密度，之后脱钙制片，行HE染色、Mankin评分及BMP-2、MMP-13免疫组化染色;取右膝胫骨近端包埋，制成硬组织切片，用于骨组织形态计量学测量。[结果](1)Mankin评分：仙灵骨葆组显著低于盐水组。(2)股骨远端骨密度及胫骨近端软骨下骨骨量：仙灵骨葆组均显著高于盐水组。(3)免疫组化：仙灵骨葆组MMP-13的表达显著低于盐水组，BMP-2的表达显著高于盐水组。[结论]仙灵骨葆125 mg/(kg·d)灌胃能够部分阻止骨关节炎兔关节软骨的退变，其作用机制可能与下调MMP-13的表达，上调BMP-2的表达，同时增加软骨下骨骨量，改善其微观结构有关。 　　关键词： 仙灵骨葆; 骨性关节炎; 软骨细胞; 软骨下骨; BMP-2; MMP-13 　　　　骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种以关节疼痛、晨僵及功能损伤造成的活动受限为临床特征的慢性疾病。其病理学特点为降解代谢胜于合成代谢关节软骨的变性，表现为糜烂、溃疡和脱失、软骨下骨硬化和骨赘的形成。流行病学数据显示[1]在中老年人群中,骨关节炎是一种发病率较高的、非常普通的肌肉骨骼疾病，但目前还没有找到真正能够治愈的方法和药物[1]。研究发现[2～4]，仙灵骨葆(XLGB)对成骨细胞和破骨细胞都具有显著的调控作用，并能改善骨小梁三维结构[5]，可能存在对OA治疗的巨大潜力。 　　本研究旨在观察仙灵骨葆对骨关节炎模型兔关节软骨的保护作用，同时检测软骨下骨量及骨关节炎发生促进因子MMP-13及骨关节炎发生保护因子BMP-2的表达，以期进一步探讨其可能的作用机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 动物分组与处理 　　健康3个月龄雌性日本大耳白兔30只(购自北京维通利华公司，批号：SCXK京，XX-0002)。随机分为三组：对照组(Sham)、盐水组(ACLT+NS)和仙灵骨葆组(ACLT+XLGB)。盐水组和仙灵骨葆组行右膝关节前交叉韧带切断术(anterior cruciate ligament transaction, ACLT)。造模术后，ACLT+XLGB组行每日1次仙灵骨葆(贵州同济堂公司)灌胃125 mg/(kg·d)，ACLT+NS组给予等量生理盐水灌胃。Sham组只打开右膝关节，不行前交叉韧带切断术,缝合膝关节。 1.2 标本采集和处理 　　三组实验动物于6周后处死并取材。将胫骨近端固定于70%酒精，冠状面锯开胫骨，脱水固定，经甲基丙烯酸甲脂包埋，作5 μm切片，Giemsa染色。采用骨组织形态计量学方法测量软骨下骨骨小梁。股骨远端测量骨密度，股骨髁置于4%多聚甲醛中固定，15%EDTA-2Na溶液脱钙，石蜡包埋，作4 μm连续切片。行HE染色、BMP-2和MMP-13免疫组化染色。 　　1.3 免疫组织化学(SABC法) 　　4 μm连续切片，平铺于涂有多聚赖氨酸的载玻片上，烤片4 h，脱蜡至水。3%过氧化氢冲洗10 min，PBS冲洗3次×5 min，复合酶37℃修复10 min。滴加抗兔BMP-2和MMP-13多克隆一抗抗体(购自武汉博士德)，37℃湿盒孵育2h。滴加生物素化二抗(购自武汉博士德)，高敏过氧化物酶复合物，DAB显色，苏木素复染，脱水透明，中性树胶封片。 　　1.4 观察指标 　　HE染色观察采用Mankin法评分，免疫组化切片观察染色情况，骨密度测量并记录三组标本股骨远端1/3骨密度和内(r1)外(r2)侧髁软骨下骨(软骨下0.2～0.6 cm间)的骨密度。Giemsa染色切片用Leica DMLB2荧光/光学显微镜及Leica DC300数码摄像系统进行观察与摄取图像;在20倍物镜下取软骨下骨板至骨骺上骨板间骨小梁为观察范围，每个切片随机选3个视野，测定骨组织形态计量学相关指标参数。 　　1.5 统计学分析 　　实验数据建立Excel数据库，采用SPSS 12.5统计软件进行单因素方差分析，两组间采用独立性“t”检验，以x-±s表示，以P　　2.3 免疫组化BMP-2、MMP-13染色切片结果 　　MMP-13免疫组化染色，关节软骨细胞阳性表达的胞浆和胞外基质被染成棕黄色。Sh