江南大学开报告.ppt

* 直 博 工 作 汇 报 汇 报 人：李 蓓 个人简介： 2003年7月毕业于河南师范大学生命科学学院生物技术专业，同年9月开始攻读山东大学生命科学学院细胞生物学专业硕士，师从张举仁教授，研究方向为植物细胞工程与基因工程。目前已修完硕士研究生培养方案规定的课程，成绩优秀。 　 此外，选修了基因组学与蛋白质组学专题、分子细胞生物学进展、细胞分化等博士生课程；阅读了《植物分子遗传学》、《从基因到基因组》等专业书目，在理论水平上有一定提高； 除课程学习、实验室研究工作正常进行之外，还大量阅读与专业有关的各类文献资料， 思路方面有了一定的扩展。 已经熟练掌握了农杆菌介导的烟草叶盘遗传 转化技术；掌握了质粒重组、DNA和RNA的提取、PCR及SDS等分子生物学技术。 从黑豆及荷豆2#中克隆了hsp热诱导启动子，并进行了功能验证。 参与重组酶FLP的克隆和重组酶作用位点frt 的构建，并将它们构建入植物表达载体，转化烟草进行了功能验证。 下一阶段的工作计划和目标 利用FLP/frt系统去除转基因玉米的选择标记及耐盐相关基因的聚合 实验目的： 利用FLP/frt定点重组系统，获得去除选择标记基因的玉米转基因植株； 利用二次转化或者有性杂交的方法获得去除选择 标记基因的基因聚合植株； 探索高效获得无选择标记基因植株的途径与方法。 实验背景： 选择标记基因被广泛的用于植物转基因中转化子的筛选工作，目前最常用到的选择标记基因大多数为抗性标记基因(resistant marker gene)。随着转基因植物的商品化种植，抗性标记基因在生态环境和食用方面潜在的安全性隐患就成为颇有争议且悬而未决的问题，因此培育无抗性标记基因的转基因植物已成为基因工程育种的重要目标。 完全避免使用抗性标记基因 使用安全性标记基因 获得转基因阳性植株后将抗性选择标记基因除去 共转化系统 (Co-transformation system) 以转座元件为基础的系统 (Transposable element-based system) 同源重组系统 (Homologous recombination) 染色体内部的重组系统 (Intrachromosomal recombination system) 位点特异性重组系统 (Site-specific recombination system) 在植物基因工程中常用的位点特异性重组系统主要有以下几种： 来自于噬菌体P1的Cre/lox系统 来自于酿酒酵母的2μm质粒中的FLP/frt系统 来自于接合糖酵母Zymosaccharomyces rouxxi的 pSR1质粒的R-RS 系统 来自于Mu噬菌体的Gin重组酶系统 FLP-frt 定点重组系统 来自于酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 的2μm质粒。 该系统包括： FLP重组酶 (FLP recombinase) frt (FLP recombination target) 重组酶作用位点 FLP酶催化frt位点间的特异性重组：根据frt位点 位置和方向的不同，催化DNA片段的倒位、切除和整合。 1993年，Lyznik等利用FLP酶的瞬时表达系统，以玉米和水稻的原生质体为材料首次证明了FLP/frt系统在植物中的定点重组功能。 1994年，Lloyed和Davies通过对烟草稳定转化体的研究验证了FLP/frt系统的功能。 1996年，Lyznik等通过对玉米愈伤组织的研究也证明了该系统的功能。 2000年，Hong Luo等利用FLP/frt重组系统从雄 性不育的转基因拟南芥植株中获得了育性恢复的植株，表明该系统可为杂交种或杂交植物的获得提供一条可供选择的途径。 工作基础： 已构建植物表达载体： pCAMBIA1300-35S-flp-hpt pCAMBIA1300-35S-antiport-frt1-als-frt2 pCAMBIA1300-35S-CDH- frt1-als- frt2 pCAMBIA1300-35S-hsp1- flp-hpt pCAMBIA1300-35S-hsp2- flp-hpt 已构建原核表达载体： pET-42-b(+)-FLP 图为含有重组酶FLP基因的植物表达载体pCAMBIA1300-FLP 图为选择标记基因两侧带有同向frt位点的植物表达载体 Fig. Enzyme digested characterization of