双缩脲测定蛋白质含量 双缩脲测定奶粉中蛋白质的含量.doc

双缩脲测定蛋白质含量 双缩脲测定奶粉中蛋白质的含量 双缩脲法测定奶粉中的蛋白质含量 【摘要】 目的 尝试建立一种快速准确地测定奶粉中蛋白质含量的方法。方法 使用双缩脲法测定蛋白质的含量，在540 nm波长处，分别测定标准蛋白质应用液与样品稀释液的吸光度值，基于测定液中蛋白质含量与其吸光度值呈正比关 系… “蛋白质与生命活动” 一、教材中与“蛋白质”有关的知识点归纳： 二、知识概要 1、生命中的蛋白质：蛋白质是生物体内一种重要的高分子化合物，是生命活动的承担者。它对生命 的重要性体现在两个字：质和量 质：蛋白质是生命活动的体现者，有什么样的蛋白质就表现… 关于“斐林试剂”和“双缩脲试剂”替代使用的实验探究 ——以高中生物第一册教材实验一为例 毛彬彬 (湖南省平江县第四中学 414511) 高中生物（必修·人教版）第一册教材P.17中的“生物组织中还原糖、蛋白质的鉴定”实验中对“斐林试剂”和“双缩脲试剂… 双缩脲法测定奶粉中的蛋白质含量 【摘要】 目的 尝试建立一种快速准确地测定奶粉中蛋白质含量的方法。方法 使用双缩脲法测定蛋白质的含量，在540 nm波长处，分别测定标准蛋白质应用液与样品稀释液的吸光度值，基于测定液中蛋白质含量与其吸光度值呈正比关 系，计算出样品中蛋白质的含量。 【关键词】 奶粉；蛋白质；双缩脲法；标准曲线 1【前言】 蛋白质是人类最重要的营养物质之一。因此，奶粉中蛋白质含量一直是食品检测中的重要指标。目前蛋白质定量方法较多, 如凯氏定氮法、紫外分光光度法和Lowry 法等。虽然凯氏定氮法目前是测定蛋白质含量的国家标准方法，但其操作繁琐费时，且蛋白质含量是通过测定氮的含量推算得来的，容易被其他含氮物质干扰（如2008年9月“问题奶粉”的出现源于有人利用凯氏定氮法的缺陷，向牛奶中添加三聚氰胺造成蛋白质含量虚高）；Lowry法和紫外分光光度法存在显色所需时间长，灵敏度低，稳定性差等缺点［1］。为弥补这些不足，本实验利用双缩脲法快速测定奶粉中的蛋白质含量。 2 实验目的 （1）学习从奶粉中提取酪蛋白的原理和方法； （2）掌握利用双缩脲法对蛋白质含量的测定的原理和方法； （3）掌握利用分光光度法对物质的定性和定量测定的原理和方法； 3实验原理 3.1奶粉中提取蛋白质的原理 奶粉中主要蛋白质是酪蛋白，每100克婴幼儿奶粉中含12克～25克。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将奶粉用蒸馏水溶解，然后将其PH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂质杂质后便可得到纯酪蛋白。 3.2双缩脲测定蛋白质的原理 当脲加热至180oC时，两分子脲缩合，放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性条件下能与硫酸铜生成紫红色络合物，即发生双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键，与双缩脲结构相似，故蛋白质与碱性硫酸铜也能形成紫红色络合物,在一定条件下其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，可用来进行蛋白质定量。最大波长位于540nm处。本法测定蛋白质范围1-10mg 4实验设备 可见光分光光度计1台、离心机1台、电热器1台、电子天平（0.01 g）1台、pHS-3C酸度计1台、烧杯、试管15支、漏斗、移液管若干、胶头滴管2~3支、离心管等。 5实验材料和试剂 5.1材料与试剂 奶粉，双缩脲试剂，体积分数95%乙醇120ml，无水乙醚120ml，0.2mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液 牛血清白蛋白标准溶液 蒸馏水 5.2缓冲液的配制 缓冲溶液300ml（先配置A液和B液） A液（0.2mol/L醋酸钠溶液）：称NaAc·3H2O5.44g，定容200ml B液（0.2mol/L醋酸溶液）：称优级纯醋酸（含量大于99.8%）2.4g，定容至200ml 取A液177Ml，B液123ml，混合既得PH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲溶液300ml 操作 6 奶粉中真蛋白含量的测定 6.1标准应用曲线的绘制 操作步骤： 2.各管混合后，加入双缩脲试剂3.0mL,37oC反应30min。 3. 以0号管调零，测定各管540nm光吸收值。 4.以蛋白质浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，制作标准曲线。 :6.2样品制备与测定 1.称取一定量的奶粉，用蒸馏水将其溶解至饱和 2.将100ml奶粉溶液加热至40，在搅拌下慢慢加入预热至40、PH4.7的醋酸缓冲溶液，用精密PH试纸或酸度计调PH至4.7。将上述悬浮液冷却至室温。离心15min(3000r/min)，弃去上清夜，得酪蛋白粗制品（或用细布过滤，收集沉淀） 3.用水洗沉淀3次，离心10min(3000r/min)，，弃去上清夜 4.在沉淀中加入30ml体积分数95%乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗