应用DNA改组技术构建水蛭素突变体库..doc

? 湖北生物科技职业学院 学生毕业论文 论文题目：应用DNA改组技术构 建水蛭素突变体库 ? ? 系别： 生物工程系 专业：生物技术及应用 年级：0510 姓名：宁晓微 学号：0501011018 指导老师： 艾炎军 ? ?2007年11月18日?摘 要 水蛭索是水蛭中抗凝血蛋白质的一种，它对凝血酶有强烈抑制作用：水蛭索的三维构象与水蛭中作用于血小板糖蛋白Ⅱb—Ⅲ a的拈抗剂decorsin十分相似，而该拮抗剂是以RGD保守序列作为识别序列的。本文试图通过水蛭素定向进化获得既抑制凝血酶又抑制血小板凝集的双功能抗凝剂。因此，本文运用DNA改组技术，在重组反应中掺入含RGD基序的化学合成的寡聚核苷酸，得到水蛭素各种变异体基因，然后将此突变体基因片段插入噬菌质粒pCANTAB 5\ G8，转化大肠杆菌，建立水蛭索突变体噬菌体表面展示库。建库后，分别用凝血酶和血小板对这个库进行亲和淘选，初步结果显示，在实验定向进化中可看出选出的突变体抗凝血酶活性与血小板结合能力都随着淘选而提高。并且当一种选择压力消失时，在该压力下选择出的某性状也会随之减弱。因此，在适宜选择条件下有希望从突变体库中选择出既抑制凝血酶又与血小板有结台能力的双功能水蛭素突变基因。进一步的淘选工作和DNA测序鉴定工作正在进行中。、 关键词：水蛭素；DNA改组；亲和淘选。 ? ? ? ?目 录 摘 要 ……………………………………………………………………………………………1 目 录 ……………………………………………………………………………………………2 引 言……………………………………………………………………………………………3 1材料和方法………………………………………………………………………………………5 1.1材料…………………………………………………………………………………………5 1.1.1试剂和菌种………………………………………………………………………5 1.1.2器材………………………………………………………………………………6 1.2方法………………………………………………………………………………6 1.2.1改组联合随机片段的插入………………………………………………………6 1.2.2 pCANTAB 5V G8／HIndⅢ,BamHI大片段与水蛭素基因的连接……………………8 1.2.3 构建水蛭素突变体库…………………………………………………………9 结 论………………………………………………………………………………………………12 致 谢………………………………………………………………………………………………15 参 考 文 献………………………………………………………………………………………16 引 言 ? 水蛭是我国的传统中药，早在1800年前的《神农本草经中就有记载。中医认为水蛭有破血、逐瘀、通经等功效。1884年Havcraft发现医用水蛭的提取物中含有抗凝血的物质。1955年 Markwardt从水蛭头部分离纯化出一种蛋白质,命名为水蛭素(Hirudin)，并于1970年确定为凝血酶的特异性抑制剂，由此开始了对吸血水蛭中抗凝血物质的多方面研究。一系列的动物实验和临床研究表明，水蛭素能高效抗凝血，抗血栓形成，阻止凝血酶催化的凝血因子活化和血小板反应，抑制凝血酶诱导的多种细胞增殖，水蛭素可用于治疗各种血栓性疾病，尤其是治疗静脉血栓，弥漫型血管内凝血，促进手术后伤口愈合和预防动脉血栓等。研究还表明，水蛭素能阻止许多肿瘤细胞的转移，在肿瘤治疗中也能发挥一定的作用。 水蛭素是水蛭唾液腺分泌的一种具有强烈抗凝血作用的小分子蛋白质。水蛭素通常是由65或66个氨基酸残基组成的单链多肽，分子量为7000道尔顿左右。分子中不含精氨酸、甲硫氨酸和色氨酸。水蛭素分子N端区域有三对二硫键(C6—C14，C16—C28，C22一C39)，使其形成紧密的空间构象。水蛭素的C端是一酸性区，其最后九个氨基酸残基中有五个是酸性氨基酸，并有一个硫酸酯化的酪氨酸(第63位)。 水蛭素是凝血酶的天然抑制剂，它和凝血酶以l：l的比例形成紧密的非共价结合的稳定复合物，解离常数为10-11mol／L～10-14 mol／L。水蛭素-凝血酶复合物的三维结构显示：水蛭素的 N端结合域覆盖在凝血酶的活性位点，C端与带正电的血纤维蛋白原结合位点呈多点结合，其中 N端三个氨基酸与凝血酶活性位点的接触至关重要。许多研究表明，水蛭素是一多位点作用的抑制剂，其N端和C端结构域分别都有抗凝血活性，二者通过接头区