重组DNA的转化题库.pptVIP

* 所以含有这类载体的菌落就很容易在含有底物X-Gal和诱导物IPTG的平板上分辨出来。因为这类菌落中释放出的蓝色物质可以将整个菌落染成蓝色，非常容易辨别。 * 细菌用胰蛋白胨 、细菌培养用酵母提取物 、IPTG 中文品名: 异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 、X-Gal是β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的显色底物 重组DNA的转化 掌握用CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。 学习和掌握质粒DNA的转化方法及操作步骤。 一.实验目的 二. 原理 质粒必须通过转化，才能进入细菌内进行扩增。转化效率的高低与受体菌的生理状态有关。用CaCl2处理细菌可以提高细菌吸收周围环境中的DNA分子,这种状态的细菌被称为感受态细菌。 冰冷条件下，CaCl2能使细菌细胞膨胀，细胞壁通透性增强，转移到42℃下进行短暂热刺激，待转化的外源DNA便会被细胞所吸收。 决定细菌转化效率（频率）的因素有：DNA的浓度、纯度和构型；转化细胞的生长状态；在CaCl2处理和储藏之后的存活率以及转化的环境条件如：温度、pH值、离子浓度等。 ?-互补 (alpha-complementation) 大肠杆菌?-半乳糖苷酶 可以和其底物X-Gal 相互作用并且释放出一种蓝色物质，当该酶的?-片段和?-片段分开时就失去了这种显色的功能。通常将编码该酶?-片段的LacZ 基因插入到载体的多克隆位点的侧翼序列中，而在一些人工构建的大肠杆菌株系中却只能编码产生该酶的?片段。这样一来，含有功能性完整的LacZ 基因的载体导入到这类寄主细胞中时，载体编码的 ?-片段就能和寄主编码的?片段发生互补并具有了对底物X-gal的作用功能（发生显色反应），这种现象被成为是 alpha-complementation. 组质粒的筛选 plasmid DNA host DH5? Lac Z-N端 Lac Z-C端 ?-互补 ?-半乳糖苷酶基因 三. 试剂与器材 〈一〉试剂 bacto-tryptone 、 bacto-yeast extract 、NaCl 、 Agar 、Amp、 X-gal、IPTG 〈二〉器材 37℃温箱、水浴锅、超净台、离心机 1．制备选择培养基: 在100ml水中加入: 　 bacto-tryptone 1.0g 　　 bacto-yeast extract 0. 5g NaCl 1.0g Agar 1.5g Amp(100mg/ml) 100μl X-gal(100μl/ml ) 200μl IPTG(250μl/ml) 10μl 四.操作步骤 ? 2.在连接反应物中取5 ?l 加于50 ?l 感受态细菌，冰浴中放置30分钟。 3.热击：42℃热激90秒后， 4.冰镇：立即放回冰浴中。3分钟 5.复苏：每管加LB液体（不加抗生素）500 ?l，于37 ℃振摇45分钟。 6.涂皿：取适当体积(200μl)均匀涂布于选择培养基上。 7.培养： 37 ℃倒置平皿培养12-16小时，观察蓝白斑。（冰箱4 ℃使X-gal充分显色） 8.挑菌：用枪头挑取白色单菌落，打入装有2ml液体LB培养基的离心管中，摇菌8h。 * 所以含有这类载体的菌落就很容易在含有底物X-Gal和诱导物IPTG的平板上分辨出来。因为这类菌落中释放出的蓝色物质可以将整个菌落染成蓝色，非常容易辨别。 * 细菌用胰蛋白胨 、细菌培养用酵母提取物 、IPTG 中文品名: 异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 、X-Gal是β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的显色底物