急性创伤性深静脉血栓消退与不消退差异表达基因研究..doc

急性创伤性深静脉血栓消退与不消退差异表达基因研究 中文摘要 目的：在建立大鼠急性创伤性肢体深静脉血栓动物模型基础上，应用Affymetrix基因芯片技术，从基因水平研究血栓形成后，消退与不消退两种不同病理过程间股静脉中差异表达基因，探索影响创伤性肢体深静脉血栓消退的部分关键因素。 方法：1. 分组：250只SD大鼠（雌雄不限）随机取20只作为对照组，余230只据创伤造模后血栓形成病理变化过程分为：创伤即刻组（B组，造模后0.5小时）、血栓形成前期组（C组，造模后2.5小时）、血栓形成高峰期组（D组，造模后25小时）、血栓消退期组（E组，造模后72小时）、血栓不消退组（F组，造模后72小时）和血栓不形成组（G组，造模后72小时）。 2. 造模：对照组大鼠不造模，创伤组大鼠造模时不行麻醉，造模方法为：双侧腹股沟区碘伏液消毒后行内侧切口，长约1cm，暴露出股动、静脉及股神经，稍作钝性分离显露长约1.5cm的股静脉，用12.5mm全齿蚊式血管钳分三段各钳夹血管1次（力量为血管钳紧1扣，每次持续3秒）后，用1号丝线全层间断缝合皮肤切口，不放置引流，除对照组、创伤即刻组外大鼠均行双后肢髋人字石膏固定；造模后观察大鼠双足颜色和肿胀情况。 3. 取材方法：对照组大鼠不造模即取材，创伤即刻组于造模后0.5小时，其余各组大鼠在相应时相点沿原切口暴露股静脉，观察血栓形成状态，符合分组标准后，用3％的戊巴比妥钠溶液按1ml/kg体重，腹腔内注射麻醉，仰卧位固定，碘伏液消毒双后肢前内侧皮肤区域后，沿双侧股静脉走行切开皮肤约4.5cm，观察局部组织反应、股静脉血栓是否形成、严重程度及消退、不消退情况，分别记录；显微镜下分离并切取双侧各长约4.5cm的股静脉及主要属支，留长约0.5cm的血管用甲醛固定，送HE染色组织切片镜检；0.9%生理盐水冲洗干净血管中的血液或血栓，离体30秒内放入冻存管，置入液氮罐中保存，用于总RNA提取。 4. 总RNA提取：TRIzol法分别提取上述7组股静脉标本总RNA；各组总RNA样品经琼脂糖凝胶电泳检测合格后（28SRNA和18SRNA条带整齐，两者带宽比值超过2倍）分为两份，一份送以进行基因芯片检测，另一份备用以行RT-PCR检测。 5. 芯片及RT-PCR检测：按Affymetrix RAT 230A表达谱芯片操作流程，经cDNA探针制备、杂交、洗脱、染色、扫描，完成芯片检测；应用RT-PCR技术检测保留的RNA样品中IL-1β、Cinc2表达情况，并与芯片数据作比较。 6. 数据筛选及分析：通过倍数变化分析方法（两组间同一基因的Signal log2 ratio比较，差值必须≥1或≤-1，常规认为具有差异性），选取血栓消退与不消退组差异表达基因，应用Gene Cluster 3.0分析软件聚类（能更容易地选取共表达的基因组，提示可能具有相似功能），绘制直观曲线图，并行GO功能分类，查询“NCBI”、“CNKI”网站及期刊文献，搜寻相应背景知识资料，结合表达变化规律综合分析。 结果: 1. 250只SD大鼠共死亡5只，其中3只因造模过程中股动脉破裂，出血死亡，造模后25小时内2只死于肺栓塞，其余大鼠均存活；D、E、F、G四组190只大鼠死亡5只， 25小时有126只血栓形成，D组取材用去25只，余101只观察至72小时，64只血栓消退，37只血栓不消退；至72小时又有23只发生血栓，36只一直无血栓形成；动物死亡率2％，血栓发生率80.54％，血栓消退率63.37％，血栓不形成率19.46％；HE染色股静脉组织切片镜检证实：大体观察血栓形成状态进行的分组准确可靠。 2. 各时相点7份标本总RNA经琼脂糖凝胶电泳检测，28SRNA和18SRNA条带整齐，两者量的比值超过2倍，样品质量好、无降解。 3. Affymetrix RAT 230A芯片所能检测的15866个基因中，7389个基因有差异表达，占总数的46.57%，全部时相点均无变化的有8477个，占总数的53.43%；主要涉及促分裂素原活化蛋白激酶、Ca++、黏附斑、刺激神经的配体-受体相互作用、细胞因子-受体相互作用、核糖体、肌动蛋白细胞骨架、Wnt、嘌呤代谢、白细胞经内皮迁移、胰岛素、糖酵解/糖异生等信号通路。 4. 消退组与对照组比较，Log2 Ratio≥4.0的上调表达基因24个，无功能描述基因14个，有部分GO功能描述基因10个（Top2a、Stk6、Slpi、Olr1、Kdap、Itgam、Il6、Cd8a、Brca1、A2m），主要涉及DNA、蛋白质代谢和炎症反应等生物学过程；Log2 Ratio≤-4.0的下调表达基因9个，无功能描述基因4个，有部分GO功能描述基因5个（Lepr、Gpd3、Atp1b4、Af6、Adh7），主要涉及细胞间