抗缺氧物质灌胃的小鼠的抗缺氧能力测定和Hsp70的表达..docVIP

抗缺氧物质灌胃的小鼠的抗缺氧能力测定和Hsp70的表达 青海大学附属医院(810001) 王晓临 河南师范大学科技部重点实验室(453000) 徐存栓 四川大学华西医院肿瘤研究所教育部重点实验室(610041)王修杰 广州美晨药业卫生部重点实验室(510075) 王冬杰 中国科学院西北高原生物研究所(820001) 张宝琛 摘要： 目的：研究抗缺氧物质对小鼠的抗缺氧能力的影响，及Hsp70的表达。方法：小鼠100只，随机分为塞隆肌肉（高原鼢鼠）组、高海拔牦牛肉组、石榴籽组、红景天组和空白对照组，连续灌胃(ig) l 0天，于常压下进行抗缺氧实验和Western Blot测定Hsp70的表达。结果：红景天组、石榴籽组、塞隆肉组小鼠密闭缺氧存活时间延长；塞隆肉组、石榴籽组、 红景天组灌胃的小鼠的Hsp70表达被诱导出现。结论：抗缺氧物质(即红景天胶囊、石榴籽超临界萃取物、 塞隆肉超临界萃取物) 灌胃的小鼠密闭缺氧存活时间均延长；抗缺氧物质灌胃的小鼠的Hsp70的表达增强，说明抗缺氧药物可诱导Hsp70的表达，Hsp可以作为一种抗缺氧药物的研究和测试指标。 关健词： 抗缺氧物质灌胃 抗缺氧能力测定Hsp70 热休克反应 中图分类号: R282.71﹢R364.4 热休克反应是原核细胞还是真核细胞在所处环境的突然发生变化时表现出特殊的适应性的改变，如细胞代谢及基因表达的改变等，Welch et al[1] 经果蝇的幼虫在37.5℃孵化20min后发现了一些与热反应有关的蛋白，他们认为这些蛋白与热有关，故将之称为热休克蛋白（Heat shock protein,Hsp）,这种反应 称之为热休克反应。理化和生物学因素可引起热休克反应如：炎症、辐射、发热、病毒感染、缺氧、缺血再灌注、重金属离子、乙醇等多种有害刺激均可诱导原核和真核细胞合成这类蛋白质,Hsp是一类高度保守蛋白 [2]，又被称作“分子伴侣” [3]， Hsp分为若干个家族[4,5]，Hsp对于细胞在生长发育以及在各种病理生理条件下完整性的维持和功能的发挥都有着不可缺少的作用。药物刺激可引起的Hsp70的表达 [6,7,8,9]。Hsp在对抗缺氧、自由基损伤、缺血再灌注等因素引起的细胞氧化应激损伤中有着积极的保护 [10]。本文通过对抗缺氧物质灌胃的小鼠耐常压缺氧实验和Western Blot测定Hsp70的表达，验证了抗缺氧药物刺激可以诱导Hsp70表达出现，探索出Hsp可以作为一个指标（即药物是否具有抗缺氧作用）。 材料和方法 1 试剂 主要化学药品及试剂:丙烯酰胺（acrylamide,Sigma公司）、双丙烯酰胺（bidsarylamide,Fluka公司）、Ｎ，Ｎ，Ｎ，，Ｎ，－四甲基乙二胺（TEMED，Bio-Red公司）、明胶（gelatin,Sigma公司）、曲拉通X-100（TtitonX-100,Bebco公司）、十二烷基磺酸钠（SDS，Serva公司）、三羟甲基氨基甲烷（Tris-base,上海巴期生物公司）、标准分子量蛋白（Serva公司）、考马斯亮蓝R-250（Coomasie Brillant boue R250,Fluka公司进口分装）、雪山奶粉（青海省果洛洲奶粉厂）、鼠抗人Hsc70/Hsp70单抗隆抗体（StressGen,SPA-820,能与人、灵长目动物、啮齿动物和牛Hsc70/Hsp70的N端1—80按基酸残基区域特异结合）、碱性磷酸酶标记羊抗鼠lgL（北京中山公司）、氯化硝基四氮唑蓝（NBT，Sigma公司）、吲哆基-磷酸二钠盐（BCIP，B.M公司）、硝酸纤维素膜（Gibco公司）、吐温20（Tween20，Sigma公司）、牛血清白蛋白（BSA，华美生的工程公司）、二氨基联苯胺（DAB，北京中山公司）、二乙基焦碳酸酯（DEPC，Sigma公司）。本实验所用的其他化学试剂均为分析纯。塞隆肌肉（高原鼢鼠-Myospalax baileyi）的超临界萃取由广州美晨药业完成，高海拔牦牛肉及石榴籽的超临界萃取由甘肃省轻工研究所完成。 2动物分组及处理 购入体重1 8g-22g昆明种小鼠(青海地方病研究所)100只，雌雄各半，饲 养3天后,随机分为塞隆肌肉（高原鼢鼠）组、高海拔牦牛肉组、石榴籽组、阳 性药物对照组和空白对照组，每组20只 , 正常进食饮水。将海拔5000m牦牛 肉、塞隆肌肉、石榴籽的超临界萃取物以l 0％浓度连续灌胃(ig)；阳性药物对 照为红景天组，以青海三普药业红景天胶囊(批号:青卫药准字1999第000373 号)配制成10％溶液灌胃；空白对照组则给予等量的蒸馏水灌胃。每只小鼠每天 灌胃剂量为0．02ml／g体重，灌胃时间为