相位层析显微镜..docx

相位层析显微镜摘要：本文介绍了在多个角度使用相移激光干涉显微术得到定量的活细胞或组织折射率的三维分布的技术。我们展示细胞和多细胞组织的层析成像，和基于时间变化的细胞的结构。我们的结果可以定量分析样品带来的在高分辨率显微镜下的像差，而且，在组织散射中也有很多的应用。关键词：激光干涉显微术；折射率；三维分布。引言高分辨率光学显微镜不仅受到光的衍射性质的局限，并且由于样品的光学不均匀性，其分辨率也受很大的影响。如果能够精确的测量由折射率变化造成的像差，自适应光学[1]和反褶积技术[2]可以很好的用来纠正样品所引起的像差。但是，所有的修正手段或技术都需要样品折射率的三维定量分布场。折射率展示了其在分析细胞结构的一个独特视角，在分析细胞或组织的光散射效应，单分子光镊，流式细胞仪，全内反射显微镜，光与细胞或组织相互作用等的各个研究领域中，样品的折射率分布均有重要的应用。传统的细胞折射率测量技术只能得到单细胞的平均折射率，而且忽略了亚细胞结构带来的空间变化。此外，测量样品需要浸泡在不同折射率的折射率液中，并且需要使用相衬显微镜[3]进行观察。这一过程极其繁琐，而且受到一些限制：由于测量细胞需要浸泡在折射率液中，必须选择合适的折射率液从而不使细胞的形貌产生改变。最近，已经报道了使用显微镜原理精确测量样品平均折射率的技术[4,5]，其能够定量精确测量由于样品带来的相移。但是三维空间的折射率分布测量还没有实现。一个测量三维折射率的技术是基于测量不同投影方向的折射率，其类似于X射线断层扫描，测量各个投影方向的吸收系数。空间折射率的投影测量已经通过几种可以定量测得相位的显微镜技术[4,6,7]实现。还有更早的两项研究使用光束旋转[8]或是样品旋转[9]的方式得到了样品的断层扫描图像。但是在使用光束旋转的实验中，折射率的定量测量资料没有给出[8]而在需要样品旋转的实验中，则必须将样品浸泡在丙三醇中并且需要将样品放进微管进行旋转测量[9]。研究内容我们提出了一种高分辨率定量测量样品三维折射率的技术，这项技术可以测量悬浮的或者是在基底上的细胞，亦可以测量多细胞样品，且不需扰动样品或是将样品浸在特殊的媒介物中。装置（图1）是基于马赫-曾德外差干涉仪[10]，可以使参考光产生频移，从而使马赫-曾德外差干涉仪产生基于时间变化的定量相位图像。氦氖激光器的光束（波长为633纳米）被分束镜分成了两束：一束为物光，另一束为参考光。在油浸聚光透镜与物镜之间放置的是一个倾斜的扫描全反镜，其是用来调节入射光进入样品的角度。在参考光路中，激光光束经过两个声光调制器（AMO），使激光的频率移动1250赫兹。第二个分束镜的作用是将物光与参考光移动到同一光路中，使之在像平面上形成干涉条纹。对于每个入射角度，互补金属氧化物半导体摄像头（CMOS）（Photron 1024PCI）拍摄4张图片，速度为5000帧图像/秒。两连续帧之间，物光相位与参考光相位的差是Pi/2。随后使用相移干涉术对相位图像进行计算处理（补充方法已经放在网络上）。图1 相位显微断层扫描术。BS1和BS2分别代表分束镜1和分束镜2；GM代表扫描全反镜；L1代表焦距为250毫米的透镜；BF代表聚光透镜的后向焦平面；L1代表焦距为200毫米的透镜。通过样品的激光束（物光）使用激光的原有频率，在图中用红色表示，经过频移的激光用作参考光，在图中用蓝色表示。图中呈现了一个使用宫颈癌细胞作为样品测量的典型干涉花样。对于近场光波入射折射率差异较小的薄样品时，入射场的相位等于折射率与光在样品内的传播距离乘积的线积分，其是一个相当好的近似。因此，相位图像可以简单的认为描述了投影方向的折射率。类似于X射线层析的各个投影方向的吸收率。（参见网络上本文的补充说明图1，为一幅相位几何投影图。）为了从投影相位图片重建三维断层折射率，我们应用基于选择性后向投影法的程序[11]。我们对光束入射的方向的每一个元胞采用了离散反随机变换，其中x指坐标中的倾斜方向，θ指物光方向与物镜光轴之间的夹角。为了弥补的成像和入射的方向，我们首先让x除以cosθ。入射角度通过聚光器和物镜的数值孔径限制于|θ|60度。为了减小投影衰减效应，我们应用迭代约束法。(补充方法和补充软件在网络上）为了验证我们仪器的测量准确程度，我们首先测量了浸在稍低折射率油溶液里的颗粒直径为10微米的聚苯乙烯颗粒折射率断层图片。（Polysciences，在波长为633纳米时折射率为1.588；Cargille，在波长为633纳米时折射率为1.559）断层图片显示：颗粒内部的折射率和周围包裹的液体（油溶液）的折射率的差为delta n=0.0285 ± 0.0005，符合颗粒与油溶液两者折射率差为0.029的条件。我们还使用了折射率从1.55到1.59各种不同的油溶液进行相似的实验，结果都很好