细胞工程(整理).docxVIP

绪论1生物技术是以生物科学为基础，利用生物个体或生物器官、组织、细胞的特性和功能，设计构建具有预期性状的新物种或新品系（包括细胞系），以及与工程原理相结合进行产品加工生产的综合性技术体系。 2生物技术的内涵主要：运用现代生物学理论与科学技术改造细胞的遗传物质，培育出人们需要的生物新品种；工业规模地利用现有生物体系，制备生物产品；模拟生物体系，以生物化学工程代替化学工程，制备工业产品；发展相应的科学理论与工程技术。3主要技术范畴包括： 基因工程、细胞工程、发酵工程 、生物化学工程、 蛋白质工程 、代谢工程 。4细胞工程的概念 ：指应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，通过某种工程学手段，在细胞整体水平或细胞器水平，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品的一门综合科学技术。5动物细胞与植物细胞培养的不同：①能进行离体培养的材料范围不同，全能性体现上差别。 ②所需要的培养条件不同。光照、营养 ③生长形式不同。6动物细胞工程 的研究范畴：动物细胞培养、动物细胞融合、干细胞和组织工程、胚胎工程、克隆技术、动物生物反应器、染色体工程 、低温冷冻技术 7植物细胞工程的研究范畴：植物组织培养技术 、细胞培养技术 、原生质体融合与培养技术 、染色体工程、低温冷冻技术、转基因植物。第二章 1.污染对培养细胞的影响及污染的检测: 1）细菌污染对培养细胞的影响及污染物的检测: 取10ml 细胞悬液离心1000 转5 分钟，沉淀中加入无抗生素培养液2ml,将细胞放培养箱培养。2)真菌污染对细胞的影响及污染物的检测: 污染后易于发现，大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面，肉眼可见；有的散在生长，镜下可见呈丝状、管状、树枝状，纵横交错穿行于细胞之间。3）支原体和病毒污染对细胞影响及污染物的检测: 支原体污染后，因为它们不会使细胞死亡可以与细胞长期共存 ; 支原体污染的检测:①相差显微镜观察 支原体在镜下呈暗色微小颗粒，多位于细胞与细胞之间，有时可见类似于布朗运动的表现。②低涨处理地衣红染色观察 取已在培养瓶中的支持物盖片或培养液，用新鲜配制的0.5%枸椽酸溶液处理盖片细胞。镜下观察见支原体呈暗紫色小点，位于细胞外或细胞之间。③荧光染色法观察 用荧光染料Hoechst33258，此染料能与DNA特异地结合，可使支原体内的DNA着色，然后用荧光显微镜观察。荧光显微镜下支原体呈绿色小点，散在于细胞周围或附于细胞表面。④电镜检测 若条件许可，可用扫描电镜或透射电镜观察。4）细胞交叉污染对细胞的影响及污染物的检测: 这种污染能使细胞的生长特性、形态特征等发生变化，有些变化较轻、不易察觉，有些可能由于污染的细胞具有生长优势最终压过原来细胞而导致细胞的生长抑制，最终死亡。常用观察细胞形态学、分析生长特性和核型、检测细胞的标记物等方法检测交叉污染的细胞。2.污染的预防 : (1)添加抗生素 (2)从物品、用品消毒灭菌着手:1）细胞培养所用物品清洗、消毒要彻底，各种溶液灭菌除菌要仔细，并在无菌试验阴性后才能使用。 2）操作室及剩余的无菌器材要定期清洁消毒灭菌。(3)从操作者做起: ①进无菌室前要用肥皂洗手，按规定穿隔离衣。工作开始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和烧灼瓶口。②操作者动作要轻，必须在火焰周围无菌区内打开瓶口，并将瓶口转动烧灼。 ③操作时要常更换吸管 (4)防止细胞交叉污染:1）在进行多种细胞培养操作时，所用器具要严格区分。2）在进行换液或传代操作时，注射器和滴管不要触及细胞培养瓶瓶口，以免把细胞带到培养液中污染其他细胞。3）细胞一旦购置或从别处引入，均应及早留种冻存，一旦发生污染可重新复苏培养。 (5)无菌室的彻底消毒:1)?0.1%新洁尔灭全面彻底擦洗无菌室;2）甲醛熏蒸法：甲醛是一种广谱灭菌剂菌，其水溶液和气休对各种细菌、芽孢及真菌等微生物均有杀灭作用。 3.污染的排除 :1）抗生素排除法: 一些有价值的细胞被污染后，仍需要用抗生素挽救，可采用5－10 倍于常用量的冲击法，加入高浓度抗生素后作用24－48 小时，再换入常规的培养液，有时可以奏效。2） 加温除菌 :根据支原体耐热性能差的特点。 将受支原体污染的细胞置于41 度中作用5－10 小时（最长可以达18 小时）杀灭支原体。3） 动物体内接种:受微生物污染的肿瘤细胞可以接种到同种动物皮下或腹腔，借动物体内免疫系统消灭掉微生物，肿瘤细胞却能在体内生长，待一定时间，从体内取出再进行培养繁殖。 4)与巨噬细胞共培养 :在良好的体外培养条件下巨噬细胞可以存活7－10 天，并可以分泌一些细胞因子支持其他细胞的克隆生长。与体内情况相似，巨噬细胞在体外条件下仍然可以吞噬微生物并将其消化。 第三章4动物细胞培养:定义： 模拟体内生理环境使分离的动物细胞在体外生存、增殖的一门技术。 应用领域：