H9亚型禽流感病毒的分子生物学鉴定.docVIP

H9亚型禽流感病毒的分子生物学鉴定 H9亚型禽流感病毒的分子生物学鉴定 1材料与方法 　　毒株 　　H9N2亚型AIV、H3N8亚型AIV、H4N6亚型AIV、H5N1亚型AIV、传染性喉气管炎病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊炎病毒、鸡新城疫病毒等毒株由中国农业大学动物流感研究室保存并提供。 　　引物的设计、合成与筛选 　　根据H9亚型禽流感病毒的HA基因的序列，通过DNAman 软件进行比对，找出HA基因的保守区，针对HA基因的保守区序列设计特异性引物，并在Genbank上进行Blast检测比对分析，用软件分析上下游引物是否匹配，将分析合格的引物送上海生工生物技术有限责任公司北京合成部合成。合成了针对HA基因的5对引物，用中国农业大学流感研究室分离保存的H9N2亚型AIV进行筛选，根据扩增效率确定引物对。确定上游引物H9-F：5′-TGTGGCAACTGAAGAAAT-3′；下游引物H9-R：5′-ACCAACCTCCCTCTATGA-3′；退火温度为5℃。目的片断长度为42bp。 　　主要试剂 　　TRIzol Reagent 由invitrogen公司生产；反转录试剂盒K1622，Fermentas；氯仿、异丙醇、乙醇等均为市售；GoldenView由北京索莱宝公司生产。 　　亚型AIV病毒含量的测定 　　取感染H9N2亚型禽流感病毒A/CK/SD/ZB/XX的尿囊液，作10倍倍比稀释，每个稀释度接种3枚鸡胚。3℃孵育4h，将鸡胚于℃过夜，收获尿囊液，测定其血凝效价，按Reed-Muench法计算半数感染量。 　　病毒RNA的提取与cDNA的合成 　　取感染H9N2亚型AIV毒株A/CK/SD/ZB/XX的鸡胚尿囊液Trizol法提取病毒的总RNA，将干燥的RNA用11 μL DEPC 水溶解，立即做RT-PCR的扩增或-80 ℃保存备用。 　　将Unit 121 μL加到含RNA的11 μL DEPC 水中，瞬时离心，70 ℃水浴min后，置冰上min。依次加入5×AMV buffer μL，dNTPs μL，RNasin 1 μL，MLV 1 μL，混匀，瞬时离心，3℃ 水浴1 h，70 ℃ min，℃保存。 　　反应体系和反应条件的优化 　　对RT-PCR反应体系和变性、退火、延伸温度和时间、循环次数等条件进行优化，最后确定采用总体积为μL 的反应体系：2×PCR MIX buffer 12.μL；浓度为0 pmol/μL HA上游引物H9-F 1 μL；HA下游本文由论文联盟http://收集整理引物H9-R 1 μL；cDNA μL；ddH2O补足至2μL。最后确定RT-PCR最佳循环条件为：9℃预变性min；9℃变性30 s，5℃退火3s，7℃ 延伸3s，34个循环；然后7℃延伸10 min。 产物分析与测序 　　用最佳反应体系及条件对毒株A/CK/SD/ZB/XX进行PCR扩增，将产物进行回收纯化，送北京华大基因科技股份有限公司测序。 　　特异性试验 　　用建立的RT-PCR方法分别对H9N2亚型、H3N8亚型、H4N6亚型、H5N1亚型AIV及ILTV、IBV、IBDV、NDV的鸡胚尿囊液进行PCR扩增，分析该检测方法的特异性。 　　敏感性试验 　　对已确定病毒含量的毒株A/CK/SD/ZB/XX的尿囊液进行100、10-1、10-2、10-3、10-4等不同稀释度稀释。对不同稀释度尿囊液进行PCR扩增，分析该检测方法的敏感性。 　　检测方法的应用 　　取经HI常规方法鉴定的H9亚型AIV感染鸡的组织样品8份，称量，研磨，加含双抗的PBS制成10%～20%质量分数的悬液。℃ 1000 r/min离心10 min，取上清接种10日龄SPF鸡胚，收集24～7h死亡及未死亡的鸡胚尿囊液。对实验室保存的10株H9N2亚型AIV及以上8个样品分别用该方法进行PCR扩增。 　　2结果与分析 　　病毒含量的测定结果 　　经测定H9N2亚型禽流感病毒A/CK/SD/ZB/XX的尿囊液，病毒含量为1×/100 μL。 　　扩增结果 　　H9N2亚型AIV A/CK/SD/ZB/XX的扩增结果见图1。获得了42bp的目的条带，与预期产物大小相符。 　　测序结果 　　将HA基因扩增片段测序结果在NCBI流感数据库中进行Blast比对，HA基因序列与A/Chicken/Shandong/A1/2016、A/Chicken/Zhejiang/611/2016等毒株的第4个片段HA基因的同源性为99%。 　　特异性试验结果 　　H9N2亚型AIV扩增出42bp的目的条带。而NDV、H3N8亚型AIV、H4N6亚型AIV、H5N1亚型AIV、ILTV、