最低抑菌浓度(MIC)测定..docVIP

 附件3.4 最低抑菌浓度（MIC）测定 菌悬液的制备 刮取18～20小时的培养物，在管壁上充分研磨后混悬于1ml缓冲液中，借助比浊仪，调菌悬液浓度至104/ml，于1小时内用多点接种仪接种（放置室温应大于25℃）。 MIC测定 抗菌药物储存液制备 抗菌药物称量及配制：根据各抗菌药物的纯度称取，以目前所用抗菌药物为例。 抗菌素 纯度 称量（mg） 加溶剂(ml) 储存液浓度(mg/ml) 四环素 100% 3.2 1 3200 大观霉素 63.4% 40.38 1 25600 头孢曲松 81.5% 2.45 1 2000 环丙沙星 84.4 3.8 1 3200 分装与保存：每管200ml，-70℃可保存一年。 抗菌药物工作液制备 青霉素： 管号 原液 0 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 浓度(?g/ml) 3200 1600 800 400 200 100 50 25 12.5 6.25 3.12 1.56 0.78 取量(?l) 200 → 200 → 200→ 200 → 200→ 200→ 200 → 200→ 200 → 200 → 200→ 200→ 200 溶剂(?l) 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200  四环素: 管号 原液 0 1 浓度(?g/ml) 3200 1600 800 取量(?l) 200 → 200 → 200 溶剂(?l) 200 200 200 大观霉素： 管号 0 7 6 5 4 3 2 1 浓度(?g/ml) 25600 12800 6400 3200 1600 800 400 200 取量(?l) 200 → 200 → 200 → 200 → 200 → 200 → 200 → 200 → 溶剂(?l) 200 200 200 200 200 200 200 200 头孢曲松: 管号 原液 0 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 浓度 (μg/ml) 2000 200 100 50 25 12.5 6.25 3.12 1.56 0.78 0.4 0.2 取量(μl) 40 → 200 → 200 → 200 → 200 → 200 → 200 → 200 → 200 → 200 → 200 → 200 溶剂(μl) 360 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200  环丙沙星： 管号 原液 0 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 浓度(ug/ml) 3200 1600 800 400 200 100 50 25 12.5 6.25 3.12 1.56 0.78 0.4 0.2 取量(μl) 200 → 200 → 200 → 200 → 200 → 200 → 200 → 200 → 200 → 200 → 200 → 200 → 200 → 200 → 200 溶剂(μl) 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 抗菌药物梯度培养皿的制备 培养皿编号：按各抗菌药物浓度编号。 将配制好的各抗菌药物工作液150μl加到各培养皿中，与15ml 50℃预温的培养基充分混匀，平放在超净台内，半开培养皿盖至培养基凝固后，用塑料袋密封保存于4℃冰箱。 菌悬液接种与培养 多头接种针以及菌液板用高压法灭菌处理，其他配件用酒精消毒处理；使用前必须确认完全烘干。 按照仪器要求将菌悬液接种于各抗菌药物梯度培养皿，接种菌后置超净台内直至菌悬液渗入。 置35℃～36℃、5%～10% CO2一定湿度的环境中培养。 记录放置时间。 培养18～24小时观察结果。 结果判读 观察细菌生长情况： 记录结果读取时间。 在适宜的光线下，观察对照培养皿的菌落生长情况，并对所有菌株进行初步鉴定（涂片染色和氧化酶试验）。 比较观察对照平皿和抗菌药物平皿，进行判读：接种点内有1个以上菌落或呈菌苔状为生长；接种点内无任何菌落或呈薄雾印迹为无生长。 MIC判读与记录： MIC是指抗菌药物能够抑制细菌生长的最小抑菌药物浓度，表示单位为mg/ml 。 记录各抗菌药物浓度平皿上细菌生长情况，在《WHO参考菌株及MIC实验结果记录表》用（+）表示生长，（-）表示无生长。 每批实验结果必须由另外一名技术人员复读、签字，以确保结果的准确性。 参考菌株的判读： 本次测定的参考菌株MIC值在标准MIC值范围内或在标准MIC值±1个浓度范围内表明本次试验有效。 本次测定的参考菌株MIC值超出上述范围则表明本次试验无效，需重新配制抗菌药物