新·仪器分析-第2章色谱分析-3HPLC.ppt

第三节 高效液相色谱法 High Performance Liquid Chromatography，HPLC 高效液相色谱法 一、概述 二、高效液相色谱仪 三、高效液相色谱的固定相和流动相 四、高效液相色谱法的主要类型及选择 一、概述 它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点．为了更好地了解高效液相色谱法优越性，现从两方面进行比较： 1．高效液相色谱法与经典液相色谱法 高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化．高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍．由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色谱配备了高压输液设备，流速最高可达103cm·min-1. 2．高效液相色谱法与气相色谱法 （l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20％．对于占有机物总数近80％的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析． (2)气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生相互作用力，仅起运载作用．而高效液相色谱法中流动相可选用不同极性的液体，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争．因此，流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便． 　(3)气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作． 总之，高效液相色谱法是吸取了气相色谱与经典液相色谱优点，并用现代化手段加以改进，因此得到迅猛的发展． 二、高效液相色谱仪 高效液相色谱仪的结构示意见下图，一般可分为4个主要部分：高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统．此外还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等． 其工作过程如下：首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出．当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图． 二、高效液相色谱仪 1．高压输液系统 2．进样系统 3．分离系统——色谱柱 4．检测系统 （l）紫外检测器 （2）荧光检测器 （3）示差折光率检测器 （4）电导检测器 1．高压输液系统 由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统．它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是核心部件． 对于一个好的高压输液泵应符合密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求． 　　　常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种．恒流泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无关；恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重视性差，它们各有优缺点． 　　　目前恒流泵正逐渐取代恒压泵．恒流泵又称机械泵，它又分机械注射泵和机械往复泵两种，应用最多的是机械往复泵． 2．进样系统 　　　高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5～30cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出．柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积．柱外展宽可分柱前和柱后展宽．进样系统是引起往前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严． 　 3 分离系统——色谱柱 色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分．柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属．玻璃管耐压有限，故金属管用得较多．一般色谱柱长5～30cm，内径为4～5mm，凝胶色谱柱内径3～12mm，制备往内径较大，可达25mm 以上． 　　　一般在分离前备有一个前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离柱的性能不受影响． 　　　柱子装填得好坏对柱效影响很大．对于细粒度的填料（＜20μm）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用． 4．检测系统 在液相色谱中，有两种基本类型的检测器．一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等．另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等．现将常用