Exp07 碱变性提取质粒DNA.pptVIP

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2017-01-14 发布于贵州
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Exp07 碱变性提取质粒DNA.ppt

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实验七碱变性质粒DNA的提取一、实验目的二、实验原理细胞裂解质粒分离乙醇沉淀溶液和试剂四、实验步骤 (1) 2ml菌液/组, 4k, 3? (2) 100?l SolⅠ,振荡1?,室温5? (3) 200?l SolⅡ,颠倒3次,冰浴5? (4) 150?l Sol Ⅲ, 同上 (5) 12k,离心8?,转上清操作步骤 (6) 等体积PCI,混匀,12k, 5?,转上清 (7) 加?Vol 3M NaAc (pH5.2),2?Vol alc (8) ?20℃放置30?, 12k,离心10? (9) 0.3ml预冷70%Eth洗沉淀, 12k, 5? (10) 干燥后溶于20?l TE, ?20℃保存注意事项摇菌时施加选择压收集菌体时尽量除尽水分加溶液Ⅱ5?后,是否变粘稠? SDS质量影响产率五、作业思考题P128 2、3、4 * 学习和掌握碱裂解法小量提取质粒的方法和原理三、实验材料、用具材料:DH5? (质粒) 用具:恒温摇床,培养箱,冰浴,灭菌锅,超净台,微量移液器,枪头,EP管,台式离心机 LB液体(100mg/ml Ap),溶液I、II、III, PCI 3M NaAc (pH5.2), 100%、70%Eth,TE ?Sol I: 50mM Glu,25mM Tris-HCl (pH8), 10mM EDTA (pH8),溶菌酶2mg/ml ?Sol II: 0.2M NaOH,1% SDS ?Sol II: 3M NaAc (pH4.8) 溶菌酶是糖苷水解酶,水解细菌细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的?-1,4糖苷键,因而具有溶菌的作用.当溶液pH小于8时,溶菌酶作用受到抑制; 葡萄糖的作用在于增加溶液的粘度,维持渗透压,防止DNA受机械剪切力作用而降解; EDTA的存在,有利于溶菌酶的作用,因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境溶液I、II、III的体积比= 1:2:1.5 LB液体M(含100 mg/ml Ap) *