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RNA-Seq数据分析从原始的数据开始，进行reads回帖，到拼接转录本，计算表达量，分析差异表达，最后可视化分析结果。 ? ? TopHat是一 个把reads回帖到基因组上的工具。首先用Bowtie把reads回帖到基因组上，然后通过拼接，我们就可以在基因组上看到一些reads堆叠起来的 区域，称为consensus,这些consensus可能是一个真的外显子，也有可能是几个外显子拼在一起的，或者一些别的情况。我们知道，经典的剪切 位点一般都有GT和AG这样的序列标志，在consensus的边界和内部，TopHat会去找这样的剪切位点，并且得到他们可能的组合。然后对于那些没 有被Bowtie贴到基因组上的reads,TopHat会对他们建立索引，去和这些可能的剪切位点比对，这样就把跨越剪切位点的reads准确地贴到基 因组上。? ? 一些比较重要的命令行选项。? ?? ? 关于插入片段长度的选项：在RNA-Seq中，会把mRNA打断成小的片段，然后对片段长度进行iding筛选后拿去测序，如果选择的片段长度是300bp，两端各测序75bp的reads,中间的插入片段长度就应该设为150bp.? ? 下面是设置插入片段长度的标准差，如果选择的片段长度比较集中，这个值可以设置的小一些，反之应该设置得大一些。? ??-G选项是提供哦呢一个已有的注释文件。如果你分析的基因组被注释得比较好了，最好能够提供这个文件，这时TopHat就会先把reads往转录组上贴，没有贴到转录组上的再往基因组上贴，最后把结果合并起来。我们知道大多数的转录组都是比基因组小得多的，而且junction reads可以直接贴到转录本上，所以这样回帖的效力和准确度都可以得到提高。 ?? ? ?标准的Illumina平台是不分链的，我们无法知道配对的reads哪个方向和转录本一致，哪个和转录本反向互补。对于分链的数据，也有两 种情况，在firststrand这种分链方法中，第二个read和转录本方向一致，第一个read和转录本反向互补，在另一种fr- secondstrand分链方法中，就刚好反过来了。所以在分析的时候一定要弄清楚自己的数据有没有分链，是怎么分链的。? ? 下面是一个模拟的RNA-Seq数据集，双端测序，有两种处理，每种处理有3个重复，这里C代表处理，R代表重复，下面用C1R1进行演示? ? 首先，要有参考序列fasta文件，也就通常说的基因组序列。?TopHat是利用Bowtie2回帖reads,我们首先需要建立Bowtie2的索引文件： bowtie2-build genome.fa(基因组文件) genome ?（注意程序和文件所在目录）? ? 我们还需要reads的fastq文件，双端测序的数据，两个fastq文件分别以下划线1和2这样的形式结尾。在实际分析中，需要对拿到的数据进行质量 评估和过滤等依稀类预处理工作，这些工作都是非常重要的。需要准备注释文件，当然它不是必须的。它可以是GTF或者GFF3格式的文件，对于注释得比较好 的基因组，在UCSC可以下载。? ?准备好后就可以运行tophat了，-p是线程数，-G是注释文件，-o是输出文件夹，选项之后就是参考序列的索引，最后是两个reads的fastq文件。? ?看里面生成的文件，align-summary文件爱你，这个文件是reads回帖的一些统计信息。90%以上的回帖比例就非常好了，当然百 分之70以上一个可以接受的范围。bam文件详细记录了reads回帖到基因组上的情况，由于这是一个二进制的文件，我们需要用samtools查看它。? ? Cufflinks是一套拼接转录本，计算表达量，计算差异表达的工具。尽可能拼接处最优可能的转录本的结构，并且估计它的表达量。?-G是提供一个注释文件，并且告诉Cufflinks不要去拼接新的转录本，只能用注释文件里提供的转录本。?-g 也是提供一个注释文件，但是Cufflinks会在这些已知转录本的指导下，拼接新的转录本。-u是告诉Cufflinks用更准确的方法去处理贴到多个位点上的reads，如果没有-u,Cufflinks只会把这些reads简单地平均分配。 比如一个read贴到了10个位置，那么每个位置分得十分之一。加-u后会先进行平均分配，然后按照这10个位置各自的表达量，计算read被分配到每个 位置的概率。实际上Cufflinks会用EM算法进行迭代，计算在观察到当前数据的情况下，最优可能的reads分配。library type和TopHat里面差不多。这里的bam文件就是刚才TopHat运行的结果。Cuffmerge当我们使用Cufflinks处理多个数据之后，我们需要将其转录本数据整合为一个全面的转录本集合，Cuffmerge是