荧光定量PCR技术原理与结果分析解析.ppt

荧光定量PCR技术原理与结果分析 罗喜鹏 一、含义 二、优越性 三、应用 四、定量方法 五、荧光材料 六、结果分析 一、含义 实时荧光定量PCR技术(Real-Time Quantitative PCR)是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 二、优越性 特异性 荧光定量PCR具有引物和探针的双重特异性，故与传统的PCR相比，特异性大为提高。 敏感性 荧光定量PCR的敏感度通常达E2拷贝/ml，对数期分析，线性范围很宽，为0-E11拷贝/ml。一般来讲临床标本中病原体的数目为0-E10/拷贝，在此范围内荧光定量PCR定量较为准确，标本不需稀释。 重复性 荧光定量PCR结果相当稳定，因为域值设置在指数扩增期.在此阶段，各反应组分浓度相对稳定，没有副作用，CT与荧光信号的对数呈线性关系。与终点法相比CT值能更稳定，更精确地反映起始模板的拷贝数。 自动化 无PCR后续操作步骤，降低产物污染的风险性。 三、应用 用于核酸的定量如RNA、DNA的定量 用于核酸定性分析如SNP分析，基因型分析，RNA变异分析，溶解曲线分析等。 四、定量方法 1.?? 标准曲线法的绝对定量 2.?? 标准曲线法的相对定量? 3.?? 比较CT法的相对定量 五、荧光材料 荧光探针和荧光染料 ◇ ?SYBR green I ◇? 水解探针TaqMan ◇? 分子信标 ◇? 杂交探针 SYBR green I 未结合的SYBR green I 水解探针TaqMan 荧光素 淬灭剂 与目标序列互补 FAM TET JOE HEX VIC TAMRA DABCYL 探针与目标序列配对时 ，发生荧光共振能量转移 (FRET) 光 能量转移 Taq 游离的探针 荧光基团 淬灭剂 延伸时，Taq酶水解探针，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离而发出荧光，形成荧光信号 Taq 发出荧光 光 另一波长的荧光 分子信标 荧光基团 茎由互补配对的序列组成 环与目标序列互补 淬灭剂 茎(5-7bp) 环（15-30bp） FAM Texas Red 探针杂交到DNA模板 光 发出荧光 DNA 模板 淬灭剂 茎 环 光 淬灭 杂交探针 5’ 5’ 5’ 发出荧光 5’ 5’ 5’ 5’ 六、结果分析 基线（Baseline） 指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线即基线。 光域值threshold的设定 一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR3-15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在PCR扩增的指数期。 CT值 表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明，各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小，反之亦然。 基线期 指数期 线性期 平台期 荧光阈值线 CT值 融解曲线分析 融解温度TM 非特异扩增产物 目的基因产物 比较CT法的相对定量表达差异计算 假设目的基因与看家基因扩增效率相同，数学推导得出 目的基因的量=2-ΔΔCt ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)实验组-(Ct目的基因-Ct管家基因)对照 2-ΔΔCt表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数