蛋白质含量测定解析.pptVIP

蛋白质含量的测定 引言 蛋白质的定量分析是生物化学和其他生命学科最常涉及的分析内容，是临床上诊断疾病及检查康复情况的重要指标，也是许多生物制品，药物、食品质量检测的重要指标。在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，则是经常进行的一项非常重要的工作。 目前测定蛋白质含量的方法有很多种，下面列出根据蛋白质不同性质建立的一些蛋白质测定方法： 物理性质：紫外分光光度法。 化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry法等。 染色性质：考马斯亮蓝染色法、银染法。 其他性质：荧光法。 掌握蛋白质含量测定的原理和方法 学会标准曲线的绘制 熟练使用分光光度计、紫外分光光度计。 实验内容 （一）双缩脲法 （二） Lowry法 （三）紫外分光光度法 【实验原理】 蛋白质和双缩脲一样，在碱性溶液中能与铜离子形成紫色络合物（双缩脲反应），且其呈色深浅与蛋白质的含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。 但必须注意，此反应并非蛋白质所特有，凡分子内有两个或两个以上的肽键的化合物以及分子内有H2N—CH＝NH -CH2-NH2等结构化合物，双缩脲反应也呈阳性。 【实验材料】 1．分光光度计 2．试剂 （1）标准牛血清清蛋白溶液 10 mg/ml （2）双缩脲试剂： 【实验方法】 1.取12支试管分成两组，编号，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml标准牛血清清蛋白溶液 ,用水补足到1ml。 2.加入双缩脲试剂4 ml，混匀。室温放置30 min。 3.以管1（空白管）调零，在540 nm的波长下进行比色，分别记录各管的吸光度读数。 4.取两组平均值，以蛋白含量为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。 5.用同样方法测定未知样品。 【计算】 蛋白含量 722型分光光度计的使用 （1）预热仪器? 将选择开关置于“T”，打开电源开关，使仪器预热20分钟。为了防止光电管疲劳，不要连续光照，预热仪器时和不测定时应将试样室盖打开，使光路切断。（2）选定波长? 根据实验要求，转动波长手轮，调至所需要的单色波长。 722型分光光度计的使用 （3）固定灵敏度档? 在能使空白溶液很好地调到“100%”的情况下，尽可能采用灵敏度较低的挡，使用时，首先调到“1”挡，灵敏度不够时再逐渐升高。但换挡改变灵敏度后，须重新校正“0%”和“100%”。选好的灵敏度，实验过程中不要再变动。（4）调节T=0%? 轻轻旋动“0%”旋钮，使数字显示为“00.0”，（此时试样室是打开的）。 722型分光光度计的使用 （5）调节T=100%? 将盛蒸馏水（或空白溶液，或纯溶剂）的比色皿放入比色皿座架中的第一格内，并对准光路，把试样室盖子轻轻盖上，调节透过率“100%”旋钮，使数字显示正好为“100.0”。 722型分光光度计的使用 （6）吸光度的测定? 将选择开关置于“A”，盖上试样室盖子，将空白液置于光路中，调节吸光度调节旋钮，使数字显示为“.000”。将盛有待测溶液的比色皿放入比色皿座架中的其它格内，盖上试样室盖，轻轻拉动试样架拉手，使待测溶液进入光路，此时数字显示值即为该待测溶液的吸光度值。读数后，打开试样室盖，切断光路。重复上述测定操作1-2次，读取相应的吸光度值，取平均值。 （7）浓度的测定? 选择开关由“A”旋置“C”，将已标定浓度的样品放入光路，调节浓度旋钮，使得数字显示为标定值，将被测样品放入光路，此时数字显示值即为该待测溶液的浓度值。（8）关机? 实验完毕，切断电源，将比色皿取出洗净，并将比色皿座架用软纸擦净。 注意事项 （1）为了防止光电管疲劳，不测定时必须将试样室盖打开，使光路切断，以延长光电管的使用寿命。（2）取拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，而不能碰比色皿的光学表面。（3）比色皿不能用碱溶液或氧化性强的洗涤液洗涤，也不能用毛刷清洗。比色皿外壁附着的水或溶液应用擦镜纸或细而软的吸水纸吸干，不要擦拭，以免损伤它的光学表面。(4)不要混淆石英比色皿和玻璃比色皿，应分开放置。 【思考题】 1、干扰本实验的因素有哪些？ 2、是否所有的肽和蛋白质都能和硫酸铜的碱性溶液发生双缩脲反应？ 3、简述蛋白质含量测定在科研及临床疾病诊断上的应用。 【实验原理】 蛋白质与酚试剂呈色深浅与蛋白质的含量成正比，利用蛋白质的浓度与呈色的关系，制备标准曲线，来测定样品中的蛋白质含量。 Lowry法优点 本法的优点是操作简便、灵敏度高、较紫外吸收法灵敏10—20倍，较双缩脲法灵敏100倍。其不足之处是此反应受多种因素干扰。 【实验材料】 1．器材：分光光度计 2．试剂 试剂甲： 4％碳酸钠+0.2mol/L氢氧化钠（50）