活性測定方法-尹.docVIP

试剂的配制 磷酸缓冲液 50m mol/L 1.1mol/LK2HPO4（A）：11.411g K2HPO4———50ml 2. 1mol/L KH2PO4（B）：3.402g————25ml 3.50 m mol/L K2HPO4 —KH2PO4 A B PH7.0 12.3 7.7 蒸馏水至400ml PH7.8 36.32 3.68 蒸馏水至800ml 4研磨液Ⅰ：称取0.0292gEDTA ，1g PVP，用50 m mol/L K2HPO4 —KH2PO4（PH7.0）溶解定容至100ml。 SOD试剂 ①130mmol/L甲硫氨酸溶液：称取0.4849g甲硫氨酸，用50 m mol/L K2HPO4 —KH2PO4磷酸缓冲液（PH7.8）溶解定容至25ml（现配现用）。 ②750μmol/L淡蓝四唑溶液：称取0.0153gNBT，用50 m mol/L K2HPO4 —KH2PO4磷酸缓冲液（PH7.8）溶解定容至25ml（现配现用）。 ③1mmol/LEDTA-Na2溶液：称取0.0186g EDTA-Na2，用50 m mol/L K2HPO4 —KH2PO4磷酸缓冲液（PH7.8）溶解定容至50ml。 ④20μmol/L核黄素溶液：称取0.0038g 核黄素，用50 m mol/L K2HPO4 —KH2PO4磷酸缓冲液（PH7.8）溶解定容至500ml（避光保存）。 ⑤50 m mol/L K2HPO4 —KH2PO4（PH 7.8） CAT试剂 ①100mmol/L H2O2：255μl 30%H2O2，用50 m mol/L K2HPO4 —KH2PO4磷酸缓冲液（PH7.0）溶解定容至25ml ②50 m mol/L K2HPO4 —KH2PO4（PH 7.8） APX试剂 ①研磨液Ⅱ称取0.0292g EDTA ，0.0176g ASC（抗坏血酸钠(维生素C钠)）,1g PVP （聚乙烯吡咯烷酮[PVP-40]/PVP-40），用50 m mol/L K2HPO4 —KH2PO4（PH7.0）溶解定容至100ml。 ②50mmol/L K2HPO4 —KH2PO4（PH 7.0） ③5mmol/L抗坏血酸：称取0.0221g抗坏血酸，用50 m mol/L K2HPO4 —KH2PO4（PH7.0）溶解定容至25ml。 ④1mmol/LH2O2:取适量的100mmol/LH2O2,用50 m mol/L K2HPO4 —KH2PO4（PH7.0）配制。 8可溶性蛋白的测定——考马斯亮蓝G—250染色法所需试剂 ①标准蛋白质溶液（100g/ml牛血清蛋白）：称取牛血清蛋白0.025g，加水溶解并定容至25ml. ②考马斯亮溶液：称取0.01g考马斯亮蓝G—250，溶于5ml90%的乙醇中，加入10ml 85%磷酸,再用蒸馏水定容至100ml，贮与棕色瓶内。常温可保存一个月。 9.MDA含量所需试剂 (1) 0.05mol/L pH7.8 磷酸钠缓冲液； (2) 5％三氯乙酸溶液：称取 5g 三氯乙酸，先用少量蒸馏水溶解，然后定容到 100ml； (3) 0.5％的 TBA 溶液：称取 0.5g 硫代巴比妥酸，用5％三氯乙酸溶解，定容至 100ml。 . 1. SOD 超氧化物歧化酶活性的测定——氮蓝四唑（NBT）法 酶液提取：样品0.1g，加2ml研磨液研磨至匀浆，转移到离心管中，12000rpm离心20min,上清液即为酶液。 CK：不加酶液，照光，重复3次，取平均值；以不加酶液，不照光调零； 样品：加酶液，照光，重复3次，取品均值；以加酶液，不照光调零； 照光各管置于5000LX日光灯下反应15min（要求各管透光情况一致且受光情况一致，温度高时，时间缩短，低时延长） Ck对照（照光） 试剂名称 每支试管所加入的量（ml） 备注 磷酸缓冲液 1.7 以不照光的调零 甲硫aa（避光） 0.3 四唑NBT(避光) 0.3 EDTA-Na 0.3 核黄素（避光） 0.3 研磨液 0.1 样品（照光） 试剂名称 每支试管所加入的量（ml） 备注 磷酸缓冲液 1.7 以不照光的调零 甲硫aa（避光） 0.3 四唑NBT(避光) 0.3 EDTA-Na 0.3 核黄素（避光） 0.3 酶液 0.1 SOD活性测定与计算：反应结束后，分别测定各管在560nm的吸光度； 结果计算： SOD总活性=（Ack-Ae）*Vt/(0.5*Ack*W*Vc) （Ack：对照管的吸光值； Ae：样品管的吸光值；Vt：样品液总体积 ；W：样品的鲜重 Vc：测量时酶液的体积) 2过氧化物酶（CAT）活性测定（消