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浙江大学医学院神经生物学实验室常用实验流程 目 录 1、琼脂糖电泳分离的DNA片段的回收 2、感受态细胞的制备 3、DNA的转化 4、小量质粒DNA提取和纯化 5、中量质粒DNA提取和纯化 6、聚合酶链式反应操作（PCR） 7、点突变形成 8、诱导表达及检测 9、SDS和WESTERN BLOT 10、免疫共沉淀（HEK293T细胞） 11、免疫组化 12、细胞培养注意事项及常用溶液配置方法 13、细胞传代培养（消化法） 14、细胞的复苏 15、细胞冻存 16、海马神经元原代培养 17、免疫细胞化学 18、HEK 293T细胞转染 (10cm培养皿) 19、磷酸钙介导的神经元转染 20 Co--IP 21 MBP-PICKI表达纯化 22 RNA提取步骤 补充 磷酸钙转染 溶液配置 1、琼脂糖电泳分离的DNA片段的回收 （详见Axygen公司DNA凝胶回收试剂盒产品说明。） 准备工作：调整到75°C水浴；在Buffer W2 中按标签上指定的体积加入无水乙醇。 记录每个1.5 ml Eppendorf（自备）的重量：为A重量（g） 分别将两小块胶（cDNA和载体）切下、切碎，放入1.5 ml Eppendorf，再次称重： 为B重量（g） 加入3×(B-A)ml的DE-A液，75°C×7min （使胶溶解完全） 加入1.5×(B-A)ml的DE-B液，混匀 (翻转混匀即可) 短速离心，使管壁和管盖上的溶液沈降到管底。 将DNA制备管放入2ml离心管（试剂盒提供）中。将以上混合液，加入DNA制备管，5000rpm离心1分钟 弃去滤液，将制备管放回到2ml离心管中，加入0.5ml W1溶液，5000rpm离心1分钟 弃去滤液，将制备管放回到2ml离心管中，加入0.7ml W2溶液，5000rpm离心1分钟 重复一次 将DNA制备管放回到2ml离心管中，12000rpm×1min，弃此2ml离心管 将DNA制备管放入无菌1.5ml 离心管（试剂盒提供）中，在DNA制备膜正中加25ul Eluent 静置1min 12000rpm×1min，收集DNA, 约25ul 2、感受态细胞的制备 实验准备：无抗性LB平板，1ml装、6ml装LB小管，100ml装LB锥形瓶，0.1mol/L的氯化钙，0.1mol/L的氯化钙加15%的甘油，50ml离心管。 实验步骤：因为整个过程中没有使用抗生素所以要特别注意无菌操作！ 1.铺无抗性的LB平板。为避免意外，一般铺两块无抗性LB平板。 2.用1ml的枪戳几下菌库中的菌种,使得枪头上带有少量冰渣。这个过程要迅速，避免菌种发生冻融或污染。 3.将冰渣溶于1ml 37℃预热的LB中,充分混匀后,用枪吸取20ul转移至另一只装有1ml 37℃预热的LB的 EP中,混匀后取100ul涂板。37℃孵育14个小时。观察菌落数量和相关理化特征，用封口膜密封4℃冻存。 4.用牙签挑取单克隆至4～6ml无抗性LB小管中260rpm 12小时(活化)。这一步可以多挑几个克隆，以防其长不出来和有明显的污染。 5.取500ul菌液到100ml无抗生素的LB锥形瓶中300rpm 3小时。注意观察，控制菌的浓度在OD600时不要超过0.6。 6.把100ml菌液分装在两只50ml离心管（已灭过菌）中，冰浴10分钟。 7.5000rpm、4℃离心10分钟，弃上清。离心机需要4℃预冷。 8.用0.1mol/l的氯化钙10ml重悬浮。徒手将50ml离心管反复戳于冰上从而使细菌重悬浮。因为感受态细胞比较脆弱易破损，故重悬浮时不宜使用震荡仪。悬浮要充分！ 9. 5000rpm、4℃离心10分钟，弃上清。 10.用0.1mol/L的氯化钙加15%的甘油2ml重悬浮。注意事项同8。 11.以200ul每管分装，分装后冻存于-80℃。注明制备日期和菌名。 注意事项：因为培养基无抗性，故无菌操作是整个感受态制备的关键。制备过程最好带上口罩，所有的用具需要充分灭菌。为了保证感受态的质量所有的步骤都需在冰上进行。 方法二： 做感受态细胞步骤：（材料要灭菌，并无菌冰上操作） 1， 2， 3， 4， 5， 6， 7， 8， 9， 10， 11， 12， 3、DNA的转化 准备工作：制冰，42°C水浴，37°C摇床，37°C预热LB 自制的感受态细胞 加20ul