人工诱导斜带石斑鱼雌核发育的研究.docVIP

人工诱导石斑鱼雌核发育的初步研究 摘要：采用灭火的鞍带石斑鱼精子精子遗传物质进行完全灭活，灭活后的精子与斜带石斑鱼卵子相结合，获得单倍体受精卵，经冷休克加倍处理，得到雌核发育二倍体，实验结果显示：鞍带石斑鱼精子在紫外照射强度为160-240lux下，照射4min后能使精子完全灭活，处理水温4-6℃条件下，受精卵最佳处理时刻为受精后第6min，最佳冷休克持续时间为30min。 关键词：石斑鱼，雌核发育，人工诱导，紫外照射，冷休克 鱼类雌核发育工作开始于20世纪50年代，淡水鱼类开展的较多[1]，海水鱼类这方面的研究相对比较落后，目前仅在大菱鲆 (Scophthalmus maximus)[2]、牙鲆(Paralichthys oliva-ceus)[3]、真鲷(Pagrosomusmajor)[4]、漠斑牙鲆(Paralichthys lethostigma)[5] 欧鲈(Dicentrarchus labrax)[6]大黄鱼(Pseudosciaena crocea )[7]、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)[8]等有关的报道。雌核发育研究作用主要体现在三个方面，一是在一些生长差异大的养殖鱼类中构建全雌鱼或者与性转化技术相结合构建功能性雌雄鱼，然后和正常鱼交配进而得到全雌或全雄鱼，二是人工诱导雌核发育可以快速建立纯系，对提高鱼的种质质量具有重要意义，三是雌核发育后代具有高度的纯合性，能够快速淘汰劣质基因，稳定杂种优势，提高选择效率，对鱼类育种和种质资源保护具有重要意义。 石斑鱼是驰名世界的名贵海产鱼类,是中国南方沿海广东、海南、福建、广西等海水养殖的主要对象，经济价值巨大，中国石斑鱼类养殖和其他海水养殖鱼类是继海藻、贝类和虾类之后第四个海水养殖发展浪潮而兴起的[9]。斜带石斑鱼石斑鱼在分类学上隶属鲈形目（Perciformes）、鲈亚目（Percoidei）、鳍科（Serranidae）、石斑鱼亚科（Epinephelinae）、石斑鱼属（Epinephalus），有关斜带石斑鱼或者石斑鱼雌核发育的报道国内外均未见报到，本研究采用紫外灭活精子，低温冷休克的方法系统深入的研究了斜带石斑鱼雌核发育的条件，以期为石斑鱼的研究提供基础资料，同时对石斑鱼养殖产业的发展以及种质资源保护提供科学依据。 材料方法 实验材料 实验场地：海南青利水产繁殖有限公司三亚铁路港及新村渔 排。 实验仪器及器材：紫外灯箱，流式细胞仪（CyFlow? PA），Nikon显微镜，烧杯，培养皿，胶头吸管，1.5ml EP管。 实验鲜活材料：鞍带石斑鱼鲜活精子，斜带石斑鱼刚收集卵子。 实验药品：Ts-19精子稀释液，酒精，丁香酚麻醉剂，染液（PARTEC Stain DNA 1 step staining solution），PBS（PH=7.2） 1.2实验方法 1.2.1.精子遗传物质灭活 分别设置精子照射时间为0,2,4,6,8,10min，紫外照射强度为160-240lux，精子稀释液采用被实验室精子冷冻中筛选的同等条件下精子活力较好的Ts-19，精子和稀释液比例为1:9,取1ml稀释过的精子放在预冷的培养皿中，精子厚度约为0.16-2mm，紫外照射过程中保持不停的摇动以确保精子照射均匀，紫外灯箱开启约5min等待电压稳定后开始精子精子灭活，以上实验条件下分别统计受精率，受精后20h的成活率和单倍体率，以确定精子的最佳照射时间,照射过的精子放在冰面上遮光保存备用。 1.2.2.染色体倍性恢复 在繁殖期间从斜带石斑鱼亲鱼养殖网箱中挑选性成熟较好的雌鱼，人工挤卵，快速将收集到的卵和紫外灭活的精子以及正常精子相结合，冷休克处理时刻分别设置为：C1,C2,3,4,5,6,10,15,20,25,30,35min，其中C1为正常精子和卵子杂交，C2为灭活的精子和卵子杂交但不休克，其余组为休克组，分别统计受精率，孵化率和诱导率，冷休克水温保持在4-6℃,冷休克处理持续时间分别设置为C1,C2，10,15,25,30,35min，C1和C2条件同上，以上各组每组分别设计3个重复，并统计受精率、孵化率，每次冷休克完成后加入海水复温至28℃。 1.2.3.单倍体的检测 收集受精后约12h的受精卵，开始倍性检测，方法如下：取发育约12h的受精卵，在载玻片上轻压致使卵膜破裂，用PH=7.2的PBS冲洗玻片，经离心沉淀后取上层组织液100ml与1L染液混合均匀后进行检测，每次随机检测样品50个，并统计单倍体率。 1.2.4.人工受精 将鞍带石斑鱼亲鱼用丁香酚麻醉后，人工收集新鲜精液，遮光保存送到实验地点灭活，28℃水温、盐度34‰的海水里面进行人工受精，具体方法为：将收集的卵子和灭活的精子在1000ml的烧杯混合后，用羽毛搅拌均匀，先加入少量海水（