病毒的纯化与保存__培训课件.pptVIP

病毒的保存 2、冷冻干燥保存 保护剂：脱脂牛奶或血清 保护剂作用原理：在冷冻干燥的脱水过程中稳定病毒结构，防止病毒受冷冻或干燥而造成损伤。 2、冷冻干燥保存步骤 (1) 准备安瓿管(高压灭菌后备用) 2、冷冻干燥保存步骤 (2) 制备保护剂：脱脂牛奶 取市售新鲜、清洁、无抗生素污染的牛奶200 g，在5000 r/min下离心10分钟，除去上层奶皮，如此重复两次。然后分装入两个250 ml锥形瓶中，加棉塞并用牛皮纸包头、扎牢，在110℃下灭菌15分钟，冷却后备用。 2、冷冻干燥保存步骤 (3) 制备病毒悬液 (4) 分装、预冻 (5) 真空干燥 抽真空前，样品必须处于冷冻状态 (6) 封管 小结 掌握：聚乙二醇(PEG)浓缩法、差速离心法、密度梯度法分离病毒的原理以及特点； SDS的原理以及蛋白相对分子质量测定；Western Blot原理；常见的病毒保存方法。 熟悉：病毒纯化原则、其他病毒分离方法原理、SDS和Western Blot的主要步骤； PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。 催化聚合的常用方法：化学聚合法。化学聚合以过硫酸铵（APS）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。 连续与不连续PAGE PAGE按照缓冲液的pH值和凝胶孔径的差异及有无浓缩效应分为连续系统和不连续系统两大类。 连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。 不连续PAGE 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳是指使用不同孔径和不同缓冲系统的电泳，它由浓缩胶和分离胶两部分所组成。由于浓缩胶的堆积（浓缩）作用，可使样品在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带，然后在一定浓度的凝胶上进行分离。 样品颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较连续电泳系统佳。 SDSSDS：十二烷基磺酸钠 (重点)SDS是阴离子去垢剂，使蛋白质变性解聚，并与蛋白质结合成带强负电荷的复合物，掩盖了蛋白质之间原有电荷的差异，使各种蛋白质的电荷／质量比值都相同，因而在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时迁移率主要取决于蛋白质分子大小。 SDS也称变性PAGE 通常采用不连续垂直型系统 浓缩胶、分离胶 浓缩胶 分离胶 首次应用SDS的论文(了解) Laemmli UK (1970).Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685. SDS实验步骤(熟悉)1、清洗、烘干、组装 电泳器材 SDS实验步骤2、1%琼脂封底 SDS实验步骤3、配制分离胶 SDS实验步骤4、灌注分离胶 灌注完后，加水覆盖隔绝空气， 同时可使界面平整 一般20-30分钟凝固 SDS实验步骤5、配制、灌注浓缩胶，插上梳子 SDS实验步骤5、往电泳槽加电泳缓冲液，上样 2×上样缓冲液(样品溶解液 Loading Buffer)： SDS,琉基乙醇，甘油，溴酚蓝，Tris-HCl缓冲溶液。 蛋白样品与上样缓冲液1:1混合，沸水浴3分钟，离心，上样 其中一个上样孔：蛋白分子量标准 电泳缓冲液(电极缓冲液)包含SDS 一般配制成10×或5× SDS实验步骤6、连接电源，电泳开始 SDS实验步骤7、电泳结束，剥胶，染色，脱色 染色液：考马斯亮蓝； 银染法用硝酸银 脱色液：甲醇/异丙醇+醋酸 按下式计算相对迁移率：   每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分子量，这样的标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。 = 蛋 白 样 品 距 加 样 端 迁 移 距 离 c m 溴 酚 蓝 区 带 中 心 距 加 样 端 距 离 c m 相 对 迁 移 率 8、蛋白相对分子质量测定(重点) 当蛋白质的分子量在15,000－200,000之间时，样品的迁移率与其分子量的对数呈线性关系。 符合如下方程式：Lg MW =－b ? m R + K 其中，MW 为蛋白质的分子量，m R 为相对迁移率，b为斜率，K为截距。当条件一定时，b与K均为常数 因此通过已知分子量的蛋白与未知蛋白的比较，就可以得出未知蛋白的分子量 SDS实验步骤8、蛋白相对分子质量测定 注意的问题