現代医学实验仪器及实验技术.docVIP

基因转导技术（14周） 基因转移技术 将外源基因转移到受体菌或细胞内,在细胞内实现转入基因的扩增或表达的技术。它是重组DNA、基因功能研究、基因治疗的关键技术之一 方式： 转化 感染 转染 转化（Transformation）：将质粒或其它外源DNA导入处于感受态的宿主菌，并使其获得新的表型的过程 感染(Infection): λ噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA分子，在体外包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，然后才能感染适当的细胞，并在细胞内扩增 转染(Transfection):是转化和感染两个词构成的新词，指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的遗传表型的过程。如电穿孔、磷酸钙共沉淀、脂质体等 基因敲除（knock out of gene）：利用基因打靶技术，用无功能的外源基因转入细胞与基因组中同源序列进行同源重组，把具有功能的同源序列置换出来，造成功能基因的缺失或失活，这一技术叫基因敲除 基因敲进（knock in of gene）：利用基因同源重组，将外源有功能的基因转入基因组中不存在或已失活的细胞中与其基因组中同源序列进行同源重组，在细胞内获得表达，这一技术称为基因敲进 统称为基因打靶技术（Gene targeting） 常规转染技术可分为两大类： 瞬时转染：外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析 稳定转染：也称永久转染，外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，新霉素抗性基因，潮霉素B磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。 基因转导技术的分类 化学方法： 磷酸钙沉淀法 DEAE-葡聚糖 1. 磷酸钙沉淀法 目的基因与磷酸钙等物质混合，形成沉淀的DNA微细颗粒，吸附在细胞膜表面，由细胞内吞作用进入到靶细胞的细胞中，并整合到受体细胞基因组中，在适当条件下得以表达 方法简单，但转化效率低 Ca2(PO4)2+DNA → 混合微细颗粒 2. DEAE-葡聚糖和聚季胺盐转染法 q DEAE-葡聚糖或聚季胺盐均可同带负电的DNA分子聚合,形成复合物，与靶细胞作用而传递进入细胞内 q DEAE-葡聚糖具有促进靶细胞摄取DNA的作用 物理方法： 脂质体介导的转染 电击转染法 基因枪技术 显微注射法 1. 电穿孔法（electroporotion） 将细胞置于高压脉冲电场中，通过瞬间高压脉冲电压使细胞产生可逆性的穿孔（打孔），周围基质中的外源DNA可渗进细胞，进而表达 电击转染技术原理 电击转染技术是利用电转导仪在一定的电压、脉冲时间等参数下, 将外源基因导入到细胞中的一种有效方法。它是将细胞置于脉冲电场中，瞬间高压脉冲，这就有可能可逆性地在细胞膜上打出微孔（打孔） 具有操作简单, 耗时少, 节省成本等优点, 但对细胞的损伤较大, 对电压非常敏感, 所以需要有一个合适的电压, 既能使外源基因导入又尽可能让最少量细胞受损伤 影响电击转染的因素： 脉冲电压：最适电压约在200伏左右 电导电路的电容：电压脉冲等于电容量和缓冲液电阻的乘积。 缓冲液的盐度：高盐度减小了电场的阻力,导致电脉冲的作用时间变短，产生的膜孔直径变小 DNA浓度：DNA浓度上升，转导率上升 细胞数量：合适电压与细胞的大小成反比 温度 2. 脂质体介导的转染 脂质体是由双分子层组成的闭合囊泡,通过细胞的内吞或吞噬作用, 将所携带的目的基因导入细胞中 脂质复合体没有免疫原性, 组织毒性较小, 而且转染脂质体也易于制备, 因此脂质体转染已成为现今用于基因转移的最常用方法 阳离子脂质体介导转染的原理 将DNA或RNA包裹于脂质体内, 然后经脂质体与细胞膜的融合或者细胞的内吞作用导入 阳离子脂质体的表面带有正电荷,其介导的转染是基于和阳离子脂质体之间的离子相互作用, DNA通过形成一个脂质体-DNA复合物再被细胞捕获并最后表达 脂质体复合物进入细胞的方式 吸 附 细胞内吞作用介导的融合 直接与细胞质膜融合 两个关键性特点使得Lipofectamine2000的转染步骤快速简便 aDNA-阳离子脂质体试剂的复合体可以直接加入到细胞培养基中 a转染后不需要除去Lipofectamine200