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生化制备概论 一 制备主要对象及特点 对象： 蛋白质 (肽) 核酸 多糖（类）脂类 其它生物活性功能性分子 等等。 特点：蛋白质：易降解 易变性 多样性 多种因素影响活性 核酸 分子量大，易被机械切割力破坏（基因组DNA） 易降解（酶解）特别是RNA 常与核蛋白质结合 多糖 成分复杂多样，分析困难， 糖苷同样也会被多种酶降解 脂类 种类多，成分复杂，分析仪器要求较高 生物活性功能性有机分子 性质多样，有的易被氧化、有的怕光，有的怕热等等 二 物质的提取与缓冲溶液 针对蛋白质的操作一般要注意的问题：基本原则：防止生物分子变性、降解 1．控制适当的pH 2．控制低温 3．注意提取过程中的溶液环境 4．防止提纯过程中丟失一些辅助因子或亚基 1 低温 0~4度。 2 缓冲溶液提取操作，适度的离子(盐)浓度。 3加保护剂\酶抑制剂，如 巯基乙醇，DTT,，Vc,PVP,重金属络合剂， 酶的底物 蛋白酶抑制剂等等。 4操作连续，尽量快速。 5 避免剧烈搅拌。 1 蛋白质的溶液提取（抽提） 水溶液提取： 大部分蛋白质均溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中。因此蛋白质的提取一般以水为主。 稀盐溶液和缓冲溶液对蛋白质稳定性好、溶度大，是提取蛋白质的最常用溶剂。 稀释变性与盐溶现象 PH控制 缓冲溶液 材料选择与细胞破粹方法 （附渗透冲击） 离子（盐）浓度的确定 盐浓度 等渗盐溶液尤以0.02～0.05mol/L 磷酸盐缓冲液和碳酸盐缓冲液常用。 0.15mol/L 氯化钠溶液应用也较多。如6-磷酸葡萄糖脱氢酶用0.1mol/L 碳酸氢钠 液提取等。有时为了螯合某些金属离子和解离酶分子与其他杂质的静电结合，也 常使用枸橼酸钠缓冲液和焦磷酸钠缓冲液。有些蛋白质在低盐浓度下浓度低，如 脱氧核糖核蛋白质需用1mol/L 以上氯化钠液提取 PH 值： 蛋白质提取液的PH 值首先应保证在蛋白质稳定的范围内，即选择在偏离等电点两侧。如碱性蛋白质则选在偏酸一侧，酸性蛋白质选择偏碱一侧，以增大蛋白质的溶解度，提高提取效果。如细胞色素C 属碱性蛋白质，常用稀酸溶液提取，肌肉甘油醛-3-磷酸脱氢酶属酸性蛋白质，可用稀碱溶液提取。 材料选择 微生物、植物和动物都可作为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况：（1）得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；（2）利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备 细胞破粹方法 1、高速组织捣碎：将材料剪小，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等 2、玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。 3、超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100 毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。对超声波敏感物质和核酸应慎用。 4、反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 5、化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。 6渗透冲击：用蒸馏水冲击细胞或经过高渗液处理（平衡）过的细胞，让细胞内容物释放出来。 无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活