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生物下有技术期末大实验 一、实验目的： 1、熟练酵母扩大培养的技术。 2、学习酵母蔗糖酶的提取方法以及原理。 3、了解双缩脲法测蛋白质含量。 二、酵母的扩大培养: 一级培养：取新鲜苹果汁液，分装在两只经过杀菌的试管中，每只装量10~20毫升，加绵塞。在0.06~0.10兆帕压力下杀菌30分钟，冷却至常温，接入纯酵母菌1~2针，摇动分散，在25~28摄氏度下培养24~48小时，使发酵旺盛。 二级培养：用杀过菌的三角瓶（1000毫升），装鲜果汁500毫升，如上法杀菌，接入培养旺盛的试管酵母液两支，在25~28 摄氏度下培养24~28小时，待发酵旺盛期过后使用。 三、酵母蔗糖酶的提取 （一）、部分纯化试剂：1 ．啤酒酵母2 ．一氧化硅3 ．甲苯（使用前预冷到0 ℃ 以下）4 ．去离子水（使用前冷至4 ℃ 左右）5 ．冰块、食盐6 . 1N 乙酸7 . 95 ％乙醉 （二）、仪器：1 ．研钵1 个2 ．离心管3 个3 ．滴管3 个4 ．量筒50ml 1个5 ．水浴锅1 个6 ．恒温水浴7 ．烧杯1000ml 2个8 ．广泛pH 试纸 9 ．高速冷冻离心机（三）、操作步骤：1 ．提取（1）准备一个冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中。（2）称取5g 干啤酒酵母和20g 湿啤酒酵母，称20mg 蜗牛酶及适最（约10g）一几氧化硅，放入研钵中．二氧化硅要预先研细。（3）量取预冷的甲苯3Oml 缓慢加入酵母中，边加边研磨成糊状，约需60 分钟．研磨时用显微镜检查研磨的效果，至酵母细胞大部分研碎。（4）缓慢加入预冷的40ml 去离了水，每次加2ml 左右，边加边研磨，至少用30 分钟。以便将蔗糖酶充分转入水相。（5）将混合物转入两个离心管中，平衡后，用高速冷离心机离心，4 ℃, 4000rpn ，30min 。如果中间白色的脂肪层厚，说明研磨效果良好。用滴管吸出上层有机相．（6）用滴管小心地取出脂肪层下面的水相，转入另一个清洁的离心管中，4℃ ， 4000rpn，离心30min 。 （7）将清液转入量筒，量出体积，留出1 . 5 耐测定酶活力及蛋自含最。剩余部分转入清洁离心管中。 （8）用广泛pH 试纸检查清液pH ，用1N 乙酸将pH 调至5.0，称为“粗级分I”2 ．热处理 （1）预先将恒温水浴调到50 ℃ ，将盛有粗级分I 的离心管稳妥地放入水浴中，50 ℃ 下保温30 min，在保温过程中不断轻摇离心管． （2）取出离心管，于冰浴中迅速冷却，用4 ℃ ，10000 甲m ，离心10min 。（3）将上清液转入量筒，最出体积，留出1 . 5 间测定酶活力及蛋白质含最（称为“热级分II” ）。 3 ．乙醇沉淀将热级II 转入小烧杯中，放入冰盐浴（没有水的碎冰撒入少最食盐），逐滴加入等体积预冷至一20 ℃ 的95 ％乙醇，同时轻轻搅拌，共需30 分钟，再在冰盐浴中放置10 分钟，以沉淀完全．于4 ℃ ，400Orpm , 离心30min ，倾去上清，并滴干，沉淀保存于离心管中，盖上盖子或薄膜封口 ，然后将其放入冰箱中冷冻保存（称为“醇级分III ” ）。废弃上清液之前，要用尿糖试纸检查托酶活性（于下一个实验一起做）。 四、双缩脲法测定酵母蔗糖酶含量 （一）、原理： 凡含有两个以上肽键的化合物在碱性溶液中能与硫酸铜作用生成紫色或紫红色的复合物，这一反应称为双缩尿反应。蛋白质含有肽键，因而一切蛋白质均可与双缩尿试剂发生颜色反应，且颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，经与同样处理的标准蛋白溶液相比，即可求出样品中的蛋白质含量。 （二）、步骤： 1.标准曲线的制备 取6支试管按下表配成不同浓度的标准蛋白液 试 剂 1 2 3 4 5 6 标准酵母酶溶液（10mg/ml） 0.0 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 生理盐水（ml） 1.0 0.9 0.7 0.5 0.3 0.1 双缩脲试剂(ml) 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 蛋白浓度(mg/ml) 0.0 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 混匀后，于37℃水浴中保温15分钟，在520nm波长下比色，以第一管调零，测得各管的光密度。以各管的光密度值为纵坐标，以蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。 2.样品测定: （1）各级分先要仔细寻找和试测出合适的稀释倍数：详细记录稀释倍数的计算（使用移液管和量筒稀释）。下列稀释倍数仅供参考：粗级分I : 10 --50 倍 热级分11 : 10 -- 50 倍 醇级分川：10 --50 倍 确定了稀释倍数后，每个级分取3 个不同体积的样进行测定，然后取平均值，计算出各级分蛋白质浓度。 （2）取待测蛋白样品0.1ml，加生理盐水 0.9ml，再加双缩