生物化學与分子生物学实验技术.docVIP

一 血糖定量测定(GOD-PAP法) 原理 动物血液中的糖主要是葡萄糖，正常情况下，其含量较恒定。健康家兔的血糖水平为80~120 mg／dL。(dL代表100 mL。) GOD-PAP法，即氧化酶-过氧化物酶法是近几年临床血糖定量测定普遍采用的方法。该法测定血糖依据的酶反应为： 醌亚胺在A480nm~A550nm波长有最大吸收，所产生颜色的深浅与血清中葡萄糖的量成正比。在同样条件下，测定葡萄糖标准液和样品的光吸收值，即可求出样品中葡萄糖的含量。 试剂和材料 （1）血糖试剂盒：北京中生生物工程高技术公司产品，含有：葡萄糖氧化酶(GOD)13 U／mL；过氧化物酶(POD)0.9 U／mL；磷酸缓冲液：磷酸盐11 mmol／L，酚100 mmol／L pH7.0；4一氨基安替比林0.77 mmol／L；葡萄糖标准液：100 mL／dL。使用时，将90 mL磷酸缓冲液与10 mL酶制剂混匀制成的溶液为工作液。每一试剂盒装有2瓶磷酸缓冲液和2瓶酶制剂。 （2）样品：(兔血清) 操作 取3支试管，按下表加入试剂。 分别将各试管内容物摇匀，37℃保温10~15 min(避免阳光直射)。用光程为1.0 crn的比色杯，在A480~A550波长进行比色。将测得的A标准、A样品数据代入下述公式，计算出样品中葡萄糖的浓度。 式中 C：样品中葡萄糖的浓度；A标准为葡萄糖标准液在A480~A550波长的光吸收值；A样品：待测样品在A480~A550波长的光吸收值；C标准为葡萄糖标准液中葡萄糖的浓度。 注意事项 （1）试剂中含迭氮铵做为稳定剂，勿与皮肤、黏膜接触。 （2）制备样品时，血清应在收集血样后1 h内与细胞分离。加糖原酵解抑制剂(NaF，KF)后，15~25℃可贮存24 h，4℃在密闭的容器中可贮存7 d。 二 蒽酮比色定糖法 原理 蒽酮比色法是一个快速而简便的定糖方法。蒽酮可以和游离的己糖或多糖中的己糖基，戊醛糖及己糖醛酸反应，反应后溶液呈蓝绿色，在620nm处有最大吸收。 蒽酮可与其他一些糖类发生反应，但显现的颜色不同。当样品中存在含较多色氨酸的蛋白质时，反应不稳定，呈现红色。对于以上特定的糖类，反应较稳定。 本法多用于测定糖原含量，亦可用于测定葡萄糖含量。 试剂 （1）蒽酮试剂：取0.2 g蒽酮溶于100 mL 80％(V／V)硫酸中，当日配制使用；（2）标准葡萄糖溶液(0.1 mg／mL)：100 mg葡萄糖用蒸馏水定容至1 L(可滴加几滴甲苯作防腐剂)；（3）标准糖原溶液(0.1 mg／mL)：100 mg糖原用蒸馏水定容至1 L(可滴加几滴甲苯作防腐剂)。 操作 （1）制作标准曲线：取干试管6支，依次加入标准糖溶液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL，并依次用蒸馏水补足体积到1 mL，置冰浴中5 min，各管均加入蒽酮试剂4 mL，沸水浴准确煮沸10 min，自来水冷却，室温放置10 min，比色测定A620。 （2）样品含糖量测定：吸取1 mL无蛋白糖溶液置试管中，浸于冰浴中冷却，再加入4 mL蒽酮试剂，沸水浴中煮沸10 min，取出后自来水冷却后比色，其他条件与做标准曲线相同，测得的吸光度值由标准曲线查算出样品液的糖含量。 计算 式中A：为样品稀释后的体积；C：为标准曲线查出的糖含量(mg／mL)；W：为样品的重量(mg)。 三 血清胆固醇的定量测定(磷硫铁法) 原理 血清经无水乙醇处理，蛋白质被沉淀，胆固醇则溶在无水乙醇中。在乙醇提取液中加磷硫铁试剂，胆固醇和试剂生成紫红色化合物，呈色度与胆固醇含量成正比，可用比色法测定。 试剂 （1）10％三氯化铁溶液：10 g FeCl3·6H2O(A.R)溶于磷酸(A.R)，定容至100 mL。贮于棕色瓶中，冷藏，可用一年；（2）磷硫铁试剂(P-S-Fe试剂)：取10％FeCl3液1.5 mL于100 mL棕色容量瓶内，加浓硫酸(A.R)至刻度；（3）胆固醇标准贮液：准确称取胆固醇(C.P)80 mg，溶于无水乙醇，定容至100 mL；(4)胆固醇标准溶液：将贮液用无水乙醇准确稀释10倍即得。此标准液含0.08 mg／mL胆固醇。 操作 （1）吸取血清0.1 mL置干燥离心管内，先加无水乙醇0.4 mL，摇匀后再加无水乙醇2.0 mL，摇匀，10 min后离心(3000 r／min，5 min)，上清液备用。 （2）取干燥试管3支，编号，分别加入无水乙醇1.0 mL(空白管)、胆固醇标准溶液1.0 mL(标准管)、上述乙醇提取液1.0 mL(样品管)，各管皆加入磷硫铁试剂1.0 mL，摇匀，10 min后，分别转移至0.5 cm光径的比色杯内，测A505。 计算 四 紫外吸收法测定蛋白质含量 原理 蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭